紫杉醇(Taxol)是一种著名的具有多种抗癌疗效的化合物，最早从红豆杉树皮中提取获得。寻找紫杉醇合成途径中的关键酶基因能为规模化生产紫杉烷类药物奠定理论基础，紫杉烷9α-羟基化酶就是关键酶中的一个，多年来该基因序列一直没能在红豆杉中找到，说明直接从红豆杉中克隆此基因的难度很大。研究发现银杏（Ginkgo biloba）悬浮细胞能特异性地对2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-紫杉-4(20)，11-二烯(sinenxan A，缩写SIA)进行9α羟基化，表明银杏细胞含有紫杉烷9α-羟基化酶的活性，这启示如果找到银杏中紫杉烷9α-羟基化酶(taxoid9alpha-hydroxylase)编码基因，就有望发现红豆杉细胞中紫杉烷9α-羟基化酶，从而完善红豆杉紫杉醇生物合成这一重要代谢途径。本研究分析了银杏细胞转录组高通量测序的数据信息，找到了与CYP450高度同源的紫杉烷羟基化酶候选基因15个，并克隆了其中的两个基因，分别构建表达载体，进行蛋白表达、酶促反应以及LC-MS鉴定，成功得到银杏9α-羟基化酶基因，在此基础上，开展了通过类似手段从南方红豆杉细胞中寻找紫杉烷9α-羟基化酶基因的尝试。主要研究内容和研究结果如下:　　 (1)以银杏组培细胞为材料，通过CTAB法提取总RNA，再消除DNA污染，得到纯度较高的RNA;　　 (2)克隆得到同源性最高的前两个基因Contig5926和Contig5382，其中Contig5926属于CYP725家族，全长1775 bp，编码504个氨基酸;Contig5382属于CYP716家族，全长1899 bp，编码486个氨基酸;　　 (3)为表达蛋白，构建了Contig5926的酵母表达载体和无细胞表达(CFS)载体以及Contig5382的CFS表达载体，随后进行SDS-PAGE电泳鉴定和酶促反应;　　 (4)先后通过HPLC和液质联用仪(LC-MS)分析，鉴定出Contig5382基因表达的蛋白具有紫杉烷9α-羟基化酶的活性，且产物保留时间是31.86 min，该产物的保留时间和质谱与SIA9α羟基化产物标准品的保留时间和质谱完全一致;　　 (5)将该酶的编码序列blast红豆杉基因序列，又挑出8个与Contig5382高度同源的红豆杉细胞基因，随后成功克隆出其中的7个基因，并针对性地进行了4个基因的CFS表达和LC-MS分析。