日本血吸虫病(Schistosomiasisjaponica)是一种由日本血吸虫感染而引起的危害严重的人畜共患寄生虫病,主要流行于亚洲地区。该病的传播需要借助于中间宿主钉螺,其逸出的感染期尾蚴经皮肤侵入人体。成虫寄生于肝门肠系膜静脉系统,产出虫卵,最终可致慢性肝纤维化。全球范围内控制血吸虫病的流行仍是以降低发病率为主的策略,经济条件或地理环境限制了大规模灭螺的开展,因而药物化疗是目前控制血吸虫病主要手段。吡喹酮(Praziquantel,PZQ)自问世以来,因其出色的疗效和广谱的适用性被WHO指定为抗血吸虫病的首选药物。在PZQ长期大范围给药过程中,血吸虫耐药性问题也越来越引起人们的重视。目前在实验室条件下可诱导出对PZQ抗性虫体、临床上PZQ治疗不敏感案例均已有报道。因此,寻找能够替代或补充PZQ的备选新药势在必行。DW-3-15是本实验室拥有知识产权的一种PZQ新衍生物(专利号:ZL201110142538.2),在PZQ药效基团联合青蒿琥酯活性基团的设计策略上,引入过氧桥键。在前期研究中,实验室合成的DW-3-15已显示出抗日本血吸虫活性。在本课题中,借助药物公司进行商品化大量合成DW-3-15,进一步完善对DW-3-15抗日本血吸虫生物学效应的评价。同时利用蛋白组学、抗体制备等技术,对药物作用后虫体进行蛋白、转录水平检测,为深入阐明DW-3-15抗日本血吸虫作用机制及寻找潜在药物靶点提供科学依据。第一部分吡喹酮衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫的杀伤作用目的探讨DW-3-15体外对日本血吸虫不同发育阶段的杀伤效应。方法1.日本血吸虫双性尾拗经皮肤感染小鼠,感染后14d、21d及35d经肝门静脉灌注法收集童虫、(雌、雄)成虫。挑取5条成虫/孔和8条童虫/孔于6孔板,加入3 ml/孔DMEM培养基,加入终浓度50～100μmol/L DW-3-15。培养24 h后换液,加入不含药物DMEM培养基继续孵育至96 h。在培养期间,每天观察虫体活力情况及统计存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集(雌、雄)成虫,扫描电镜观察体表超微结构变化。2.挑取1对合抱成虫/孔于6孔板,向3 ml/孔DMEM培养基中加入50～100μmol/LDW-3-15共培养24h,1、6、12和24h观察合抱虫体分离情况。24h换液,加入不含药物DMEM培养基继续培养至96h,培养结束收集虫卵,统计雌虫产卵量。结果1.体外实验显示:在24～96h,随着DW-3-15浓度升高日本血吸虫(雌、雄)成虫、童虫的活力度、存活率逐渐下降;与对照组比较,50～100 μmol/LDW-3-15作用下(雌、雄)成虫和童虫活力值均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.001);100 μmol/L PZQ组雌、雄虫活力降低率为89.6%～98.5%、91.9%～97.8%,100 μmol/L DW-3-15作用下雌、雄虫活力降低率分别为91.1%～97.8%、93.3%～96.3%,两者之间差异均无统计学意义;100μmol/LDW-3-15作用下21d、14d童虫的活力值均明显低于100μmol/L PZQ组(P<0.05),降低率分别为91.7%～94.4%、95.4%～99.1%;在24～96h,50～100μmol/LDW-3-15可致合抱成虫全部分离,显著降低雌虫体外产卵量(均P<0.001)。2.形态观察显示:在96h,100 μmol/LDW-3-15作用下雌、雄虫呈极度收缩、不透明,似杆状或棒状;21d童虫皱缩而短小,虫体不透明;14d童虫收缩变短,虫体内部出现空泡状改变。在100μmol/LPZQ作用下,(雌、雄)成虫体态僵硬,呈螺旋状卷曲;21d、14d童虫体态柔和,活力正常。3.电镜结果显示:与对照组比较,DW-3-15、PZQ作用下雌、雄虫体表皮层呈多样化损伤改变,如褶嵴融合、渗出、表面剥脱、坑状或腐蚀状或泡状改变,暴露皮下肌层组织,甚至造成肌层组织损伤。结论PZQ衍生物DW-3-15体外对日本血吸虫成虫、童虫均具有显著的杀伤作用,其抗成虫效果与PZQ相仿,对童虫杀伤作用优于PZQ。第二部分吡喹酮衍生物DW-3-15体内抗日本血吸虫的生物学效应目的探讨DW-3-15体内对日本血吸虫的杀伤效应及对虫卵肉芽肿形成的影响。方法1.感染了日本血吸虫双性尾蚴的小鼠被随机分7组。在感染后35d,实验组分别灌胃100～400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分肝脏消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。2.感染了双性尾蚴的小鼠被随机分3组。在感染后14d,实验组分别灌胃400 mg/kg DW-3-15、PZQ,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。停药后21d解剖小鼠,统计减虫率、肝/体重、脾/体重;收集动物肝脏,一部分消化后统计减卵率,余下肝脏HE染色观察虫卵肉芽肿直径变化。结果1.成虫阶段治疗:随着DW-3-15用药剂量升高,小鼠体内检获虫体数、虫卵数、肉芽肿平均直径逐渐降低;与未治疗组比较,100～400mg/kg DW-3-15治疗后检获虫体数、虫卵数均显著减少(均P<0.05);400mg/kg DW-3-15治疗组减虫率、减卵率分别达64.2%、86.2%,低于400mg/kg PZQ治疗组减虫率(98.8%)、减卵率(93.5%);200～400mg/kg DW-3-15用药可使小鼠肝/体重、脾/体重显著降低(均P<0.05);400mg/kg DW-3-15治疗可减轻肝脏中虫卵肉芽肿病变,降低肉芽肿平均直径(P<0.01)。2.童虫阶段治疗:与未治疗组相比,DW-3-15治疗组小鼠体内检获虫体数、虫卵数均显著降低(均P<0.05),减虫率、减卵率分别为77.0%、95.4%,高于PZQ治疗组减虫率(17.4%)、减卵率(14.9%);DW-3-15治疗组小鼠脾脏变小,肝脏表面可见少量肉芽肿结节,质地变软,肉芽肿平均直径、肝/体重、脾/体重均显著降低(均P<0.001)。结论DW-3-15体内对14d童虫、35d成虫均具有显著的杀伤作用,可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化,具有发展成为抗日本血吸虫新药的应用前景。第三部分吡喹酮衍生物DW-3-1 5体内作用后日本血吸虫成虫的TMT蛋白质组分析目的分析DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的差异蛋白质谱,探讨DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制。方法日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d经肝门静脉灌注法收集成虫,提取虫体总蛋白。应用TMT结合液相色谱-质谱联用技术,鉴定DW-3-15治疗前后日本血吸虫成虫表达的蛋白谱,通过数据库比对,利用生物信息学对虫体表达的差异蛋白进行分析。结果在DW-3-15治疗后,雌虫表达差异蛋白407个,其中上调蛋白187个,有钙结合蛋白、myoferlin蛋白等;下调蛋白220个,有转录相关蛋白、核糖体蛋白、组蛋白乙酰转移酶等;差异蛋白主要参与核糖体代谢、内质网蛋白合成、转录等过程。雄虫表达差异蛋白41个,其中上调蛋白30个,有钙结合蛋白、跨膜蛋白等;下调蛋白11个,有肌动蛋白、鞘脂激活蛋白B等;差异蛋白主要参与钙离子结合、溶酶体代谢等。结论在DW-3-15治疗后日本血吸虫雌、雄虫中分别鉴定到与虫体生长、发育、代谢等相关差异蛋白,为DW-3-15抗日本血吸虫分子作用机制研究提供基础数据。第四部分日本血吸虫组蛋白乙酰转移酶(SjHAT)多克隆抗体的制备及DW-3-15体内对成虫SjHAT的影响目的表达重组SjHAT蛋白,制备抗SjHAT多克隆抗体,分析DW-3-15治疗前后对日本血吸虫成虫SjHAT表达水平影响,探讨DW-3-15抗日本血吸虫作用机制。方法1.采用密码子优化SjHAT表达序列,应用基因化学合成法、同源重组构建表达质粒,通过原核体系大量表达重组蛋白;重组SjHAT蛋白免疫兔4次,制备抗SjHAT多克隆抗体,ELISA检测效价及特异性IgG抗体水平。2.日本血吸虫双性尾蚴感染小鼠35d后,随机分2组。实验组灌胃400 mg/kg DW-3-15,对照组小鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠,连续5d。感染后42d收集雌、雄虫,提取虫体总蛋白;以抗SjHAT多克隆抗体为一抗,western blotting检测DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT表达水平;实时定量PCR分析DW-3-15治疗前后雌、雄虫SjHAT基因转录水平变化。结果1.成功构建了重组表达质粒petB2M-SjHAT,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得大量表达;4次免疫可产生较高水平特异性IgG抗体,得到纯化的抗SjHAT多克隆抗体(约50kDa,效价>105)。2.Western blotting分析显示正常雌虫SjHAT表达水平高于正常雄虫(P<0.05);DW-3-15治疗后雌虫SjHAT表达水平明显降低(P<0.05)。QPCR分析显示正常雌虫SjHAT基因转录水平高于雄虫SjHAT转录水平;DW-3-15可降低雌虫SjHAT基因转录水平(均P<0.05)。结论SjHAT在正常雌、雄虫中均有一定表达,DW-3-15可抑制雌虫SjHAT表达,为阐明SjHAT可能是DW-3-15抗日本血吸虫作用靶点提供依据。综上,PZQ衍生物DW-3-15在体外、内兼有抗日本血吸虫童虫、成虫生物学活性,并可缓解肝脾病变,减轻肝纤维化;TMT定量蛋白质组学鉴定到DW-3-15治疗前后日本血吸虫雌、雄虫表达的差异蛋白质谱;成功制备抗SjHAT多克隆抗体;从转录、蛋白水平分析DW-3-15作用雌、雄虫SjHAT变化。本研究系统地评价了 DW-3-15抗日本血吸虫的生物学效应,初步探讨了 DW-3-15抗日本血吸虫的分子机制,揭示了 SjHAT可能是DW-3-15抗血吸虫作用靶点,为进一步筛选抗血吸虫新药和新靶点提供参考依据。