胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)来源于囊胚内细胞团,ESC可分化为3个胚层的各种细胞并具有体外无限增殖的能力。人类胚胎干细胞(humanembryonic stem cells,hESC)的建系使ESC用于治疗人类组织器官退化性疾病成为可能。将hESC分化为各种成体细胞,有望未来应用于人类退变性疾病如帕金森氏病、阿尔兹默病、以及糖尿病等疾病的治疗。然而,来源于受精囊胚的人类双亲胚胎干细胞(human biparental embryonic stem cells,hBESC)不仅与需要行细胞组织移植的患者存在遗传学上的差异,而且目前仍然存在较大的伦理学争议。2007年我中心建立了非受精囊胚来源的hESC系,即人类孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESC)。在电激活和化学激活作用下,人类MII卵子卵浆内Ca2+振荡,使其完成第二次减数分裂,并进一步发育形成胚胎,即为孤雌激活。来源于人类孤雌囊胚的hPESC,与卵子提供者之间主要组织相容复合物(Majior histocompatibility complex,MHC)匹配,避免了移植后免疫排斥反应及破坏受精胚胎所引起的伦理学争议。　　 但是由于缺乏父源性遗传物质,hPESC的临床应用安全性值得我们进一步深入探讨。既往的哺乳动物实验表明:孤雌胚胎由于基因印记异常状态导致其无法发育至成体。在人中已发现的印记基因约有60余个。这些基因己显示在胚胎生长、特定细胞系分化中起重要调控作用。印记基因等位特异性表达通常与DNA甲基化有关。大多数的DNA甲基化发生于差异甲基化区(Differentially methylatedregions,DMRs)。DMRs中亲缘特异性甲基化使母源及父源等位基因得以区分,并调节印记基因的转录。由于孤雌胚胎中两套基因组均为母源性的,理论上母本基因将为双倍表达,父本基因缺失。人类印记基因破坏或不适当表达与某些临床综合征及肿瘤发生密切相关。因此基因组印记可能会成为hPESC用于临床治疗上的障碍。尽管鼠,兔,牛,非人灵长类,及人激活胚胎干细胞相继建立,关于孤雌胚胎干细胞(Parthenogenetic embryonic stem cells,PESC)中印记状态的认识仍然非常有限。至今没有关于hPESC中印记基因表达状态的研究。因此,评估hPESC中印记状态,以及印记基因在hPESC细胞体外长期培养及分化过程中的变化,评估hPESC表遗传的安全性具有重要意义。　　 本研究选择了目前所有有明确印记状态的人类印记基因,在2株hPESC细胞系中用高通量PCR芯片的方法测定其mRNA水平,并和hBESC比较,从整体水平全面评估hPESC的印记状态；并分析印记基因表达在长期传代中的稳定性；分析印记基因在hPESC早期分化一胚体(Embryoid body,EB)形成中表达水平的变化；用DNA甲基化测序的方法,探索印记基因表达其后的机制。　　 第一部分未分化人类孤雌胚胎干细胞与人类双亲胚胎干细胞的印记基因表达状态比较　　 研究目的：　　 1.分析未分化hPES中印记基因表达状态并与未分化hBES比较。　　 2.探讨未分化hPES体外长期培养对印记基因表达水平的影响。　　 材料与方法：　　 1.实验设计:本文选择了所有目前在人类中有明确印记状态(母源或父源表达)的基因,参见http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65个印记基因,其中父源表达(父本)基因27个,母源表达(母本)基因38个。实验材料:2株hPES1、hPES2,1株人类双亲胚胎干细胞(human biparentalembryomc stem cells,hBES)系:hBES。其中hBES设为对照组,hPES1、hPES2设为实验组。每组取早代、中代、晚代细胞,分别检测印记基因mRNA的表达。　　 2.3株人类胚胎干细胞系均培养于小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)饲养层上,按标准的人类胚胎干细胞培养方法进行培养。各取不同的6个代次:早代(p27,p37)、中代(p47,p57)、晚代(p67,p77),每隔10代各取一次细胞,提取总RNA。　　 3.对提取的RNA进行逆转录成cDNA,用PCR array的方法,进行SYBR Green实时定量PCR。　　 4.比较3组间印记基因mRNA相对表达水平的差异。　　 5.分析每组中传代次数与印记基因mRNA表达水平之间的相关关系。　　 6.比较每组中50代前后细胞的印记基因mRNA表达水平差异。　　 7.比较在体外长期培养中3组间印记基因发生变化的异同点。　　 8.分析染色体核型与印记基因表达异常的关系。　　 结果：　　 1.与对照组hBES比较,hPES1中母本基因ATP10A升高了2.7倍(P<0.05),ZNF264升高了6.5倍(P<0.001)；hPES2中ATP10A升高了2.9倍(P<0.05)；ZNF264升高了4.2倍(P<0.05)。　　 2.两株hPES细胞与hBES细胞比较,除ATP10A、ZNF264外其它25个母本基因转录水平无统计学意义的差异。　　 3.两株hPES系细胞间比较,所检测的27个母本基因的表达水平无统计学意义差异。　　 4.与hBES比较,38个父本基因中15个基因:PEG10,MAGEL2,NDN,KCNQ1OT1,SNORD109A,SNRPN,SNURF,SNORD107,SNORD64,SNORD108,SNORD109B,ZIM2,PEG3,IPW和PSIMCT-1转录水平在hPES1和hPES2中均表现为明显下降或失活。　　 5.与hBES比较,hPES1中SGCE的表达水平无统计学意义差异,hPES2中SGCE转录水平下调1.8倍(P<0.05)。　　 6.与hBES比较,其它23个父本基因在两株hPES中的转录水平均无统计学意义差异。　　 7.两株hPES细胞之间检测的38个父本基因表达水平无统计学意义差异。　　 8.在未分化hBES中,父源表达的INPP5F、KCNQ1OT1和NNAT,其转录水平与hBES传代次数显著相关；其余62个印记基因表达水平与hBES传代次数无相关关系。　　 9.比较50代前后的hBES细胞中印记基因表达水平,CALCR、PEG10、INPP5F、KCNQ1OT1的表达水平在50代后明显下降,P<0.05；而NNAT在50代后的hBES中表达水平明显升高,P<0.01。其余60个印记基因在50代前后的细胞中均无明显变化。　　 10.hPES1中SNURF表达水平与传代次数正相关(r2=.8497,P<0.05)；CDKN1C在hPES2中与传代次数呈正相关(r2=.8796,P<0.05)。hPES1中除SNURF外其余64个印记基因、hPES2中除CDKN1C外其余64个印记基因表达水平与传代次数无相关关系。　　 11.6个基因(TCEB3C,PRIM2,MESTIT1,PEG10,SNRPN,SANG)在50代后的hPES1细胞中出现明显上升,其余59个印记基因在50代前后的hPES2细胞中均无明显变化；而在hPES2中,仅仅CDKN1C在50代后的细胞中出现变化,上调2.0倍(P<0.05),其余64个印记基因在50代前后的hPES2细胞中均无明显变化。　　 12.hPES1和hPES2在体外培养70代以后,核型出现了变化,包括X染色体丢失,及平衡异位。　　 结论：　　 1.hPES细胞中绝大部分(93.0％)母本基因、超半数(hPES1:58.3％；hPES2:55.6％)父本基因正常表达,说明hPES细胞比预想(母本基因双倍表达,父本基因缺失)有更多的印记安全性。　　 2.hPES与hBES间的主要差异是hPES1中15个、hPES2中16个父本基因的下调或失活。这些父本基因的异常表达可能是hPES细胞的主要印记缺陷。　　 3.无论hPES还是hBES,在体外培养过程中,绝大部分印记基因的表达维持稳定。　　 4.hPES1与hPES2的印记状态并不完全一致,可能与体外长期培养有关。　　 5.hPES中印记基因的异常表达与染色体核型无关。　　 第二部分早期体外分化人类孤雌胚胎干细胞与人类受精胚胎干细胞的印记基因表达状态比较　　 研究目的：　　 1.探讨印记基因在hBES早期分化阶段的表达变化。　　 2.探讨印记基因在hPES早期分化阶段的表达变化,明确在未分化hPES中探及的差异表达印记基因,在hPES细胞向胚体方向分化时有无修正。　　 3.分析hPES与hBES在体外早期分化阶段印记基因变化的差异。　　 材料与方法：　　 1.实验设计:选择所有目前在人类中有明确印记状态(母源或父源表达)的基因,参见http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65个印记基因,其中父源表达(父本)基因27个,母源表达(母本)基因38个。实验材料:实验组1:hPES1分化第14天的胚体,对照组1:hPES1未分化细胞；实验组2:hPES2分化第14天胚体,对照组2:hPES2未分化细胞；实验组3:hBES分化第14天胚体,对照组3:未分化hBES。　　 2.3株人类胚胎干细胞系均培养于小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)饲养层上,按标准的人类胚胎干细胞培养方法进行培养,在细胞传代至p27、p37、p47代时,将细胞分为两份,一份用于收集并提取总RNA,另一份hES细胞用胶原酶孵育,分离,悬浮培养于干细胞分化培养液中形成胚体达14天,取分化第14天的胚体,提取总RNA。　　 3.对提取的RNA进行逆转录成cDNA,用PCR array的方法,进行SYBR Green实时定量PCR。　　 4.测定hBES体外分化第14天胚体中印记基因表达状态并与分化前比较。　　 5.分别测定2株hPES体外分化第14天胚体中印记基因表达水平,并与分化前比较。　　 6.在每个研究组中用Ontology analysis的方法对分化前后差异表达的基因进行基因功能分析。　　 7.比较hPES1、hPES2、hBES细胞分化前后基因变化的异同点。　　 结果：　　 1.与未分化hBES比较,在hBES体外分化14天的胚体中,有5个母源表达(SL,C22A2,SLC22A3,COPG2IT1,H19和CPA4),和1个父源表达的印记基因IGF2明显上调。其余印记基因在hBES的EB形成过程中未发生明显变化。　　 2.在hPES1来源的胚体中,6个基因(SLC22A2,SLC22A18,CPA4,H19和WT1)表达水平明显升高而1个基因:DLGAP2表达水平明显下降。其余58个印记基因在hPES1的EB形成过程中未发生明显变化。　　 3.在hPES2来源的胚体中,7个印记基因(SLC22A2,CPA4,H19,SLC22A18,OSBPL5,GNAS and IGF2)上调,而2个印记基因(DLGAP2和INPP5F)下调。其余56个印记基因在hPES2的EB形成过程中未发生明显变化。　　 4.在hBES来源EB中,与未分化hBES细胞比较,差异表达印记基因的基因功能分析显示:这些基因富于离子连接、离子转运及染色质重塑功能。　　 5.在hPES来源EB形成中,与未分化hPES比较,差异表达印记基因的基因功能分析显示:这些基因富于离子连接、离子转运及生物调节功能。　　 6.SLC22A2,SLC22A18(or SLC22A3),CPA4,H19和IGF2无论在hBES还是在hPES细胞的早期分化中均出现明显上调。　　 结论：　　 1.印记基因H19,IGF2,SLC22A2,SLC22A3/SLC22A18和CPA4的表达与人类胚胎干细胞早期分化发育调节有关。　　 2.在早期分化阶段,hBES与hPES的印记基因表达水平变化非常类似。　　 3.在未分化hPES中高表达的母本基因与低表达的父本基因在hPES分化为胚体后没有发生明显变化。　　 第三部分人类孤雌胚胎干细胞和人类双亲胚胎干细胞的印记基因DNA甲基化状态比较　　 研究目的：　　 1.探讨hBES中4个印记基因差异甲基化区:(SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1)甲基化状态及其在体外长期培养传代后的变化。　　 2.分析hPES中4个印记基因差异甲基化区甲基化状态及其在体外长期培养传代后的变化。　　 3.比较hPES与hBES中4个印记基因的差异甲基化区甲基化状态的差异。　　 4.探讨印记基因的差异甲基化区甲基化水平在hBES早期分化阶段的变化。　　 5.分析印记基因的差异甲基化区甲基化水平在hPES早期分化阶段的变化。　　 6.探讨hPES及受精胚胎干细胞中印记基因表达水平与差异甲基化区甲基化水平之间的关系。　　 材料与方法：　　 1.实验设计:根据第一、第二部分的结果,我们发现hPES1和hPES2中分别有15/16个父本基因表达水平异常。我们选择了4个与这些父本基因相关的印记调控中心-差异甲基化区:SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1,测定其甲基化水平。实验样本:未分化hBES,p27；未分化hBES,p77；未分化hPES1,p27；未分化hPES1,p77；未分化hPES2,p27；未分化hPES2,p77;hBES来源EB；hPES1；来源EB；hPES2来源EB。　　 2.3株人类胚胎干细胞系均培养于小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)饲养层上,按标准的人类胚胎干细胞培养方法进行培养。自早代(p27)、晚代(p77),各取一次细胞,提取基因组DNA。将hES细胞用胶原酶孵育,分离,悬浮培养于干细胞分化培养液中形成胚体达14天,取分化第14天的胚体,提取基因组DNA。　　 3.对提取的基因组DNA行重硫酸盐处理、克隆、测序,分析差异甲基化区SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平。　　 4.比较3组间印记基因的差异甲基化区SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平的差异。　　 5.比较每组中早代及晚代未分化细胞之间差异甲基化区的甲基化水平差异。　　 6.比较每组中分化前后细胞差异甲基化区的甲基化水平差异。　　 7.分析差异甲基化区SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平与相应基因mRNA表达水平之间的关系。　　 结果：　　 1.hBESC早代及晚代细胞中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均显示严格的半数甲基化。　　 2.在hPES1早代及晚代细胞中,3个差异甲基化区:KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均显示为重度甲基化状态,其甲基化水平较hBESC明显增高。　　 3.在hPES2早代及晚代细胞中,3个差异甲基化区:KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均显示为重度甲基化状态,其甲基化水平较hBESC明显增高。　　 4.hBESC分化第14天的胚体中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均显示严格的半数甲基化。　　 5.在hPES1及hPES2来源第14天的胚体中差异甲基化区:KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均显示为重度甲基化状态。　　 6.hPES1早代、晚代、分化第14天胚体中SGCE DMR显示明显去甲基化；hPES2早代、晚代、分化第14天胚体中SGCEDMR为轻度去甲基化。　　 结论：　　 1.hBESC中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均为正常的等位基因特异性基化状态,在hBESC体外长期传代及向胚体方向分化时正常甲基化状态维持不变。　　 2.2株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR维持了母源甲基化状态,3个DMRs的重度甲基化状态在hPESC长期传代及向胚体方向分化时维持不变。　　 3.两株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMRs的重度甲基化状态是导致相应父本基因静默或下调的可能因为。　　 4.hPESC中SGCE/PEG10的去甲基化是SGCE在hPESC中激活甚至正常表达的可能因为。　　 5.KVDMR1,SGCE/PEG10、PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR的DNA甲基化可能是hPESC中相应父本基因异常表达的重要调控机制及因为。