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微生物修复是降解多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)的一种绿色高效的修复方式,目前发现降解高环芳烃(High Molecular Weight PAHs,HMW-PAHs)的菌株众多,芽孢杆菌属(Bacillus sp.)因具有产生芽孢的性能及特殊功能,在降解过程中具有重要作用。本课题组前期优选到的降解HMW-PAHs的Bacillus sp.M1对培养液中5μg/mL苯并芘的去除率高达90.13%,而该菌株耐受HMW-PAHs的最大浓度、对HMW-PAHs进入胞内的方式(生物降解与吸附分配)、跨膜运输机制等尚不清晰。基于此,本文以芘(Pyr)和苯并芘(BaP)单体为研究对象,以Bacillus sp.M1为降解菌株,探索该菌体对Pyr和BaP的耐性,并深入分析M1对Pyr和BaP单体的生物降解和生物吸附的动态变化,结合qPCR技术分析功能基因降解PAHs的表达量,探明M1降解Pyr和BaP的作用机制。其主要研究结果如下:1.通过高浓度PAHs胁迫试验,明确了Bacillus sp.M1去除Pyr和BaP的耐性。在5~200μg/mL各浓度Pyr和BaP冲击胁迫下,M1在200μg/mL Pyr和BaP无机盐溶液中长势良好;M1在无机盐和LB培养液中对200μg/mL Pyr和BaP的胁迫均有较强耐受性,其中,Pyr和BaP在无机盐培养液中的去除率分别高达17.74%和29.98%,在LB培养液中分别达45.52%和91.99%。进一步分析胞内酶发现,与Pyr和BaP去除有关的胞内酶活性在LB培养液中的活跃程度优于无机盐培养液,且Pyr、BaP的去除可能与不同时间段的邻苯二酚1,2-双加氧酶、龙胆酸双加氧酶活性作用有关。2.通过Bacillus sp.M1的降解和吸附试验,探明了M1对Pyr、BaP降解吸附的动态变化特征。培养周期内芽孢杆菌M1对Pyr和BaP的生物降解率均在120 h时达高峰,为49.97%和65.02%;生物吸附率分别在168 h和72h达高峰,为19.72%和23.53%。M1对Pyr和BaP的去除由生物吸附和生物降解协同完成,在胞体吸附达到饱和时,以降解为主,其平衡时吸附量分别为1.4929μg/mL和1.7549μg/mL。3.通过低温和叠氮化钠抑制试验,阐明了Pyr和BaP的跨膜运输机制。4℃低温(抑制菌体代谢)和叠氮化钠抑制剂(抑制ATP合成代谢)处理均显著阻止了Pyr进入M1胞内,可以认为Pyr进入胞内的方式为依赖能量的主动运输;两种抑制处理显著抑制了M1降解BaP,但对吸附无明显抑制作用,推测BaP进入胞内的方式为不依赖能量的被动运输。4.通过qPCR试验,明确了不同功能基因在BaP胁迫下的表达特征。BaP诱导下芽孢杆菌M1的5个基因在第1天的相对表达量均高于其它时间,且RS10855相对表达量优于其余4个基因,5个基因相对表达量与BaP去除速率变化规律相符,且RS10855基因表达特征与龙胆酸双加氧酶活性及降解吸附特征相吻合,推测龙胆酸双加氧酶活性主要受控RS10855基因,尚需进一步验证。综上,芽孢杆菌M1对200μg/mL Pyr和BaP具有较强耐受性,M1对Pyr和BaP的去除由生物吸附和生物降解协同完成,证实了Pyr进入M1胞内的方式为主动运输,BaP为被动运输,BaP的去除可能与5个功能基因调控有关。该结果为多环芳烃的微生物修复提供了科学理论依据。