问号钩端螺旋体LA 2144基因产物PAF-AH和PLA2酶活性研究

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背景:致病性钩端螺旋体感染引起的钩端螺旋体病是全球流行的人兽共患传染病,我国也是该病流行疫区。肺出血和黄疸是钩端螺旋体病特征性病变,其中肺弥漫性出血(PDH)病人死亡率高达50%以上。尽管近年我们发现致病性问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)通过竞争性抑制假血友病因子(vWF)介导的血小板凝聚而导致出血,但钩端螺旋体病肺出血机制仍然了解甚少。问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株LA 2144基因产物注释为SGNH水解酶,SGNH水解酶超家族包括血小板活化因子乙酰水解酶(PAF acetylhydrolase,PAF-AH)和磷脂酶 A2(phosphatidase A2,PLA2),但 LA 2144 基因产物 PAF-AH 和 PLA2酶活性及其在钩端螺旋体病肺出血和炎症反应中的作用及其机制了解甚少或未见文献报道。方法:采用生物信息学软件预测致病性问号钩端螺旋体赖株LA 2144基因跨膜区、信号肽和结构域。构建无信号肽LA 2144基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2144,采用SDS-PAGE检测表达效果和提纯情况。采用表面活性剂和高聚环糊精法对rLep2144复性。提纯的rLep2144皮下注射免疫新西兰家兔获得兔抗血清,采用饱和硫酸铵沉淀和DEAE-52柱层析法分离rLep2144-IgG。采用分光光度法检测rLep2144水解2-thio PAF底物的活性及其Km和Kcat值以及水解花生四烯酸硫代卵磷脂底物的活性。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot法检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时LA 2144基因转录、蛋白表达和外分泌情况。结果:问号钩端螺旋体赖株LA 2144基因无跨膜区,但含有信号肽和SGNH水解酶超家族结构域。所构建的无信号肽LA2144基因原核表达系统能高效表达rLep2144,亲和层析法提取的rLep2144在SDS-PAGE分离胶上呈现为单一蛋白条带。rLep2144可被有效复性。rLep2144有较强PAF-AH活性,其水解2-thio PAF底物Km和Kcat值分别为688.235 μmoL/L和0.976 s-1.但水解花生四烯酸硫代卵磷脂底物的PLA2活性较弱。问号钩端螺旋体赖株感染HUVEC和EOMA后LA2144基因mRNA转录和蛋白表达水平迅速升高(p<0.05)且外分泌。结论:问号钩端螺旋体LA2144基因产物具有较强PAF-AH活性和一定的PLA2活性,可在钩端螺旋体病肺出血和脂质性炎症反应中发挥作用。
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