论文部分内容阅读
背景:肝脏缺血再灌注常发生于肝移植等肝脏外科手术过程中,可导致肝脏损伤和其他远端器官损伤,其中心脏受到的损伤尤为严重。然而,目前临床上针对肝脏缺血再灌注损伤及其诱导的远端心肌损伤尚无有效的治疗措施。自主神经系统在肝脏和心血管系统中均起到重要的调节作用。既往研究指出,在各器官发生缺血再灌注损伤时,体内交感神经系统过度激活,导致自主神经系统平衡失调,加重组织损伤。迷走神经刺激是神经调控的重要措施,在临床上常用于癫痫和抑郁症患者的治疗,其疗效和安全性较为明确。多项研究表明,迷走神经刺激可纠正自主神经系统平衡失调,在心、脑、肾和骨骼肌缺血再灌注损伤中发挥显著的保护作用。然而,迷走神经刺激在肝脏缺血再灌注损伤及其诱导的远端心肌损伤中的作用尚未阐明。目的:1.探究迷走神经刺激对急性肝脏缺血再灌注损伤的作用2.探究迷走神经刺激治疗急性肝脏缺血再灌注损伤的机制3.探究迷走神经刺激对急性肝脏缺血再灌注诱导的心肌损伤的作用4.探究迷走神经刺激治疗急性肝脏缺血再灌注诱导的心肌损伤的机制方法:本研究所用动物为SPF级成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,均饲养于12小时明/暗交替的SPF级屏障环境中,实验前给予正常饮食、饮水7天使实验动物适应环境。所有实验动物术前需禁食8个小时,通过腹腔注射浓度为1%的戊巴比妥钠进行麻醉,剂量为40 mg/kg体重。整个操作过程中用加热垫维持大鼠正常体温。实验操作严格遵守《实验动物的护理和使用指南》。1.SD大鼠随机分为3组:（1）假手术组（Sham组）:n=6,分离左侧颈部迷走神经干并连接迷走神经刺激器,但不打开刺激器开关;分离支配肝左叶和肝中叶的肝蒂,但不予以夹闭;（2）肝脏缺血再灌注损伤组（IR组）:n=6,分离左侧颈部迷走神经干并连接迷走神经刺激器,但不打开刺激器开关;分离支配肝左叶和肝中叶的肝蒂,并予以夹闭;（3）迷走神经刺激组（VNS组）:n=6,分离左侧颈部迷走神经干并连接迷走神经刺激器;分离支配肝左叶和肝中叶的肝蒂,并予以夹闭;在缺血同时打开迷走神经刺激器的开关,在整个缺血再灌注过程中予以持续迷走神经刺激,将刺激强度调整至使心率下降至约基础值90%的水平。IR组和VNS组在缺血1小时后松开血管夹以恢复血流灌注,再灌注时间为6小时。缺血再灌注过程结束后,在门静脉取静脉血以测定血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶的水平;取肝左叶组织,采用苏木精-伊红染色法和原位末端转移酶标记检测法观察病理学变化和肝细胞凋亡情况。2.SD大鼠的分组和实验操作流程同1。实验结束后,取肝左叶组织,通过试剂盒检测肝组织匀浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量及超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）的活性;通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术测定肝组织中白细胞介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的m RNA表达水平;通过蛋白质印迹法测定肝组织中B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl2-associated X,Bax）、核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB）p65、NF-κB磷酸化p65（phospho-p65,p-p65）和血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）及核蛋白中核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）的蛋白含量;通过免疫组织化学染色法测定肝组织中HO-1蛋白的表达情况。3.SD大鼠随机分为3组:假手术组（Sham组）、心肌损伤组（MI组）和迷走神经刺激组（VNS组）,每组6只。在MI组和VNS组构建急性肝脏缺血再灌注模型,在VNS组给予全程迷走神经刺激,操作过程同1。实验结束后,在下腔静脉取静脉血,测定血清中心肌肌钙蛋白-I、肌酸肌酶同工酶和乳酸脱氢酶同工酶1的水平;取左心室组织,采用苏木精-伊红染色法和原位末端转移酶标记检测法观察病理学变化和心肌细胞凋亡情况。4.SD大鼠的分组和实验操作流程同3。实验结束后,在下腔静脉取静脉血,在左心室取心肌组织,使用试剂盒分别测定血清和心肌组织中MDA、GSH的含量及SOD和CAT的活性;通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术测定心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平;通过蛋白质印迹法测定心肌组织中Bax、Bcl-2以及NF-κB p65、p-p65的蛋白含量。结果:1.迷走神经刺激显著改善了急性缺血再灌注引起的肝脏组织学损伤,降低了缺血肝叶的Suzuki病理评分;发生急性肝脏缺血再灌注后,大鼠血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶水平明显升高,迷走神经刺激显著降低了这些血清酶的水平;缺血再灌注损伤显著增加了肝组织中的细胞凋亡数目,而迷走神经刺激显著减少了细胞凋亡数目（所有p＜0.05）。2.迷走神经刺激显著抑制了缺血肝叶中的细胞凋亡过程,增加了肝组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,同时降低了促凋亡蛋白Bax的表达水平;迷走神经刺激明显逆转了缺血肝叶中的炎症反应激活,抑制了肝组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达及NF-κB p65磷酸化;缺血再灌注可引起肝组织中氧化代谢产物MDA增加和抗氧化剂GSH、SOD和CAT水平降低,而迷走神经刺激显著逆转了这些改变,抑制了缺血肝叶中的氧化应激水平;发生急性缺血再灌注后,肝脏组织中Nrf2/HO-1蛋白含量增加,迷走神经刺激进一步增加了Nrf2/HO-1的蛋白含量（所有p＜0.05）。3.迷走神经刺激显著改善了急性肝脏缺血再灌注引起的心肌组织学损伤,降低了心肌组织的病理损伤评分;肝脏缺血再灌注可导致血清心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白-I、肌酸肌酶同工酶和乳酸脱氢酶同工酶1水平升高,而迷走神经刺激显著降低了心肌损伤标志物水平;迷走神经刺激显著逆转了肝脏缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡数目增加（所有p＜0.05）。4.肝脏缺血再灌注可导致血清和心肌组织中氧化代谢产物MDA增加和抗氧化剂GSH、SOD和CAT水平降低,而迷走神经刺激明显逆转了这些改变;迷走神经刺激显著逆转了肝脏缺血再灌注后心肌组织中Bax的增多和Bcl-2的减少;迷走神经刺激抑制了肝脏缺血再灌注后心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达及NF-κB p65磷酸化,从而减轻心肌组织中的炎症反应（所有p＜0.05）。结论:1.迷走神经刺激可显著减轻急性肝脏缺血再灌注损伤;2.迷走神经刺激可抑制肝脏缺血再灌注后肝组织中的氧化应激反应、炎症反应和细胞凋亡过程,并增强Nrf2/HO-1信号通路,从而发挥对肝组织的保护作用;3.迷走神经刺激可显著减轻急性肝脏缺血再灌注诱导的远端心肌损伤;4.迷走神经刺激可抑制肝脏缺血再灌注诱导的全身氧化应激反应及心肌组织中的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡过程,从而发挥对心肌组织的保护作用。