论文部分内容阅读
目前已经有上市的JAK抑制剂tofacitinib、baricitinib、ruxolitinib、upadacitinib共四个药物。他们或多或少都有药物本身导致的致肿瘤风险或者非选择性抑制JAK2靶点导致的贫血副作用,因此研发一款安全性更好和选择性更高的JAK1抑制剂是目前市场的需求。而高选择性JAK3抑制剂NIBR3049对IL-2介导的CTLL-2细胞STAT5磷酸化抑制活性较JAK1/3抑制剂差100倍,表明JAK3在γc类细胞因子的信号通路中似乎并不关键。就市场策略而言,JAK1和JAK3在激酶结构域高度同源,选择开发JAK1/3抑制剂更加简单。为了开发JAK1/3抑制剂,本文在细胞水平分别建立了针对JAK1/3靶点和JAK2靶点的筛选平台。通过大鼠胶原诱导的关节炎模型,考察化合物KYDR001和tofacitinib在大鼠胶原诱导的关节炎模型药效和血生化变化,印证建立的细胞筛选平台结果。目的:在细胞水平分别建立针对JAK1/3和JAK2靶点的筛选平台,并评价实验体系的可行性与稳定性。再通过大鼠胶原诱导的关节炎模型评价化合物的药效及血生化影响,印证建立的细胞筛选平台的可靠性。为JAK抑制剂的筛选提供参考。方法:JAK1/3与JAK2靶点细胞筛选平台的建立:首先通过文献查找最佳的刺激剂浓度。再确定最大响应窗口下的细胞密度与孵育时间,并通过排除FBS和DMSO对体系的影响,确定最终实验体系。通过阳性药tofacitinib和baricitinib的重复评价IC50值95%置信区间是否可接受。胶原诱导的关节炎模型建立:建立胶原诱导的大鼠关节炎模型,通过足掌症状评分、足增量、疾病进程、血液白细胞数与淋巴细胞数的改善评价化合物在关节炎大鼠的药效,论证JAK1/3抑制活性细胞筛选模型的成功建立。再通过关节炎大鼠的血生化指标（红细胞数、血红蛋白、红细胞压积和网织红细胞）评价化合物对JAK2靶点的抑制活性,并与tofacitinib的血生化结果比较,论证JAK2靶点抑制活性细胞筛选平台的成功建立。结果:成功建立针对JAK1/3靶点评价的CTLL-2细胞增殖抑制评价模型和针对JAK2靶点评价的TF-1细胞增殖抑制评价模型。测定在酶学上有8.3倍选择性的化合物KYDR001在CTLL-2细胞增殖抑制评价模型和TF-1细胞增殖抑制评价模型的半数抑制浓度IC50分别为为255.5n M,496.6n M（同批次tofacitinib为213.6n M,765.2n M）,表明其在细胞水平的JAK1/3选择性不如tofacitinib。在大鼠胶原诱导的关节炎模型中,成功评价化合物tofacitinib和KYDR001的药效,认为KYDR001 30mg/kg/qd剂量下和tofacitinib 10mg/kg/qd的药效相当或稍差,通过PK-PD结果和大鼠血浆蛋白结合率结果判定KYDR001在CTLL-2细胞增殖抑制评价模型的IC50是可接受的,相互印证的。在KYDR001 30mg/kg/qd剂量和tofacitinib 10mg/kg/qd药效相当或稍差的条件下,KYDR001较tofacitinib对红细胞数、血红蛋白、红细胞压积和网织红细胞的抑制稍稍比tofacitinib强,这与KYDR001对TF-1细胞增殖抑制的评价结果是相互印证的。而且,本次实验tofacitinib 10mg/kg/qd在红细胞数、血红蛋白、红细胞压积观察到了和tofacitinib申报资料对应的抑制结果,认为大鼠CIA模型血生化指标是可以一定程度上衡量化合物对JAK2的抑制活性,对JAK抑制剂在CIA伴随血液学研究有一定的指导意义。结论:分别在细胞水平成功建立针对JAK1/3、JAK2靶点的CTLL-2、TF-1细胞增殖抑制评价模型,并在大鼠CIA模型中观察到了相互印证的结果。同时,发现大鼠CIA模型红细胞数、血红蛋白、红细胞压积三项血生化指标是可以一定程度的衡量化合物对JAK2的抑制效果。