背景/目的：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染了世界上一半以上的人口，是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病原因子，与胃腺癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的发生亦密切相关。现有的根除Hp的手段主要是联合应用抗生素，但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等，限制了抗菌药物的疗效，进行免疫防治研究十分迫切。鉴于Hp粘附于胃上皮细胞是其定植并致病的前提，阻断Hp的粘附显然可以防治Hp感染。因此本研究的目的是：选择暴露于细菌表面并与Hp定植密切相关的粘附素HpaA为目标，通过基因工程技术获得重组粘附素蛋白rHpaA，分别在体外和小鼠模型中评价其免疫原性及对Hp感染的免疫保护效果，以确定rHpaA在Hp疫苗研制中的应用价值。 方法：（1）运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出hpaA结构基因，装入pUC19载体并进行序列分析；（2）将hpaA基因亚克隆入表达载体pTrc99A并在大肠杆菌JM109中表达，硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析两步纯化表达产物rHpaA，免疫印迹法检测其抗原性；（3）流式细胞术及光镜计数法研究rHpaA及其抗体对Hp与胃上皮细胞粘附的影响；（4）ELISA法测定Hp感染者血清中抗HpaA抗体，~3H掺入法测定人外周血淋巴细胞（PBL）对rHpaA的增殖反应，体外评价rHpaA对体液和细胞免疫的影响；（5）流式细胞术检测rHpaA选择性增殖Th细胞表型的作用，探讨rHpaA可能的免疫保护机制；（6）建立Hp感染小鼠模型，在该模型中评价rHpaA、Hp超声破碎抗原（HpSON）与佐剂CT结合预防Hp感染的效果，运用半定量尿素酶试验和组织切片Giemsa染色法观察细菌定植量的改变；（7）组织切片HE染色检查免疫后小鼠胃粘膜的病理学改变；（8）ELISA法检测免疫/攻击前后小鼠血清中抗HpaA抗体产生情况。 结果：0）成功构建了砂aA的重组质粒pUC娜a，序列分析显示hpaA结构基因由 783hp组成，开放读框完整无中断，编码 261个氨基酸，其中一段氨基酸序列KRTIQK与大肠杆茵粘附素SfaS、K99、CFAjl中的涎酸结合位点的结构相似；＊仔ns二acs显示表达产物相对分子量约29kD，可溶性表达占全茵蛋白的20％以上，两步纯化后获得纯度达90％的重组蛋白枷aA，免疫印迹显示该蛋白可被幽门螺杆菌全菌抗体识别；p）rHpaA和rHpaA抗血清均能部分阻断Hp与胃上皮细胞系的粘附，在流式细胞术中表现为Kat。Ill细胞结合标记细菌的平均荧光强度下降，但仍未降为零；在光镜下表现为经抗 HpaA兔血清预处理后，每细胞周围粘附的细苗数较阴性对照免疫前兔血清预处理组明显减少（35．5土 15＊ VS 128．3土40．5，P＜0．of）；（4）ELIS法共检狈了80份患者血清，以 HpSON为平行对照，paA及 HpSON包被下的阳性检出串分别为50％O0／80）及53．75％O 卜两法检出槽况无显著性差异印＞0．05h不论培养基中是否加入IL工，p aA均可刺激Hp”PBL的增殖，加入IL2后Hp”PBL对paA的增殖幅度超过无n2时（P＜0．05）：（5）＊才＊＊L细胞与培养液、尿素酶及m纵分别孵育后，IL－4阳性T细胞比例分别为9．26％、10．2％和25．63％，HPaA可选择性提高IL－4”细胞即ThZ细胞比例（P＜0．05）；Hp“PBL细胞与上述各组分别孵育后，HpaA同样将IL4单阳性细胞从对照的z44＄提高到17．33％ （P＜o．05），且可明显发现一个小的细胞分布亚群的形成，尿素酶则无此作用；仍）兔疫各组在受末次攻击后2周及8周，Hp定植量均有不同程度下降，以rH p卯卜＊T组下降最明显o＜o．01），有佐剂组较同一抗原的无佐剂组细茵定植量明显下降（P＜0刀5），攻击后8周不论是阴性对照还是免疫组，Hp定植密度均有上升趋势；尿素酶试验和组织学检查的结果基本一致：（7）各组小鼠在Hp末次攻击后二周胃粘膜几乎均未见淋巴细胞及中性粒细胞浸润；攻击后吕周阴性对照PBS组5只小鼠均有轻到中度淋巴细胞浸润，各免疫组从CT组到HpSON组、rHpaA组炎症程度依次较轻，枷囚A＋＊T组最轻，偶见淋巴细胞0功刀1＼（8抗原免疫后Hp攻击前，tHpat组、rHpat＋CT组IgG抗体滴度即明显升高0功刀05），而 CT组、HpSON组及 HpSON＋CT组则无升高 O＞0．05）；不论是攻击前、攻击后二周或8周，p乙A组及rH＊囚A十 ．4． ＊T组的抗体水平均明显高于＊的ON组及＊咋ON十＊T组（P＜o．01）。 结论：＊）首次获得与HP定植密切相关的粘附素HPaA的基因工程 蛋白产物，为伽疫苗研制提供了一种新抗原：（2）体外粘附实验证实 地aA参与了地与胃上皮细胞的粘附过程；p田paA是具有免疫原性 的Hp菌体成分，既可以刺激体液免疫，又能够提高细胞免疫：o）于 体外首次发现HpaA能选择性增殖ThZ细胞，提高了HpaA在疫苗应用 中的可行性：归）动物实验表明巾paA联合佐剂能显著降低即在小鼠 胃内的定植密度，同时胃粘膜炎症反应减轻?