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腺苷脱氨酶ADAR1(Adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1)是作用于双链RNA上,催化腺嘌呤转换为次黄嘌呤的A-to-I RNA编辑酶家族成员之一,其与双链RNA结合蛋白发生相互作用参与相应的信号转导通路。ADAR1相互作用蛋白主要分为两类:一类是依赖RNA编辑功能发生相互作用的蛋白,如PKR与ADAR1相互作用影响病毒的复制;另一类是不依赖RNA编辑功能发生相互作用的蛋白,如NF45、NF90、h Upf1及Dicer酶等,其中Dicer酶与ADAR1相互作用促进mi RNA合成。由此可见,ADAR1与相互作用蛋白形成的复合物参与机体内重要生物学过程。肝癌是我国高发的肿瘤之一,let-7家族是在肝癌中表达较高的mi RNA,可能成为肝癌标记物。研究报道,通过高通量测序结果显示ADAR1对let-7家族部分成员具有编辑作用,另一部分研究表明ADAR1不依赖RNA编辑与Dicer相互作用促进let-7合成。而在肝癌中研究ADAR1相互作用蛋白对let-7合成的影响尚未见报道。在此基础上,本研究将采用蛋白质组学方法筛选及验证ADAR1相互作用蛋白;在肝癌中初步探讨ADAR1及其相互作用蛋白对mature let-7合成及肝癌细胞迁移能力的影响。目的筛选及验证肝癌中ADAR1相互作用蛋白;初步探讨ADAR1及相互作用蛋白与肝癌临床病理特征的相关性;初步研究ADAR1与相互作用蛋白在肝癌中对miRNA的合成及肝癌细胞迁移能力的影响。方法1.构建载体:采用GV-166构建ADAR1过表达载体,PCR及测序鉴定该载体正确性。2.包装ADAR1过表达慢病毒:将测序正确的重组质粒包装至慢病毒颗粒,瞬时感染293T细胞,采用实时荧光定量PCR检测病毒滴度及ADAR1 m RNA表达水平。3.建立ADAR1稳定过表达细胞系:在人正常胚胎肝脏L02细胞系中稳定转染ADAR1过表达慢病毒,采用嘌呤霉素筛选稳定表达ADAR1细胞,经实时荧光定量PCR及Western blot检测ADAR1 mRNA及蛋白表达水平,获得ADAR1稳定过表达L02细胞系。4.筛选及验证ADAR1相互作用蛋白:本研究结合免疫共沉(Co-Immunopreci--pitation,Co-IP)、Western blot、质谱非标记法(Label free)等蛋白质组学方法,采用非标法对蛋白进行定性分析,检测ADAR1相互作用蛋白,采用生物信息学分析筛选ADAR1相互作用蛋白。采用细胞免疫荧光的方法,鉴定ADAR1与相互作用蛋白在肝癌细胞中的定位及表达情况。5.检测肝癌细胞中ADAR1及相互作用蛋白表达情况:采用Western blot在9种肝癌细胞株中检测ADAR1与相互作用蛋白二者蛋白表达情况。6.鉴定肝癌组织中ADAR1及相互作用蛋白表达及定位:本研究采用免疫组化的方法检测8例肝癌患者的癌及癌旁组织标本中ADAR1与相互作用蛋白的表达情况,分析二者与肝癌发生发展的联系。7.筛选ADAR1相关差异表达mi RNAs:本研究采用Nano String技术对ADAR1稳定过表达L02细胞系进行mi RNA差异分析。8.下调ADAR1及相互作用蛋白,研究ADAR1及相互作用蛋白在肝癌中对mi RNA processing的影响:应用si RNA干扰技术,设计ADAR1及相互作用蛋白的si RNA干扰序列,瞬时感染人肝癌细胞MHCC97-H、人正常胚胎肝脏细胞L02和ADAR1稳定过表达L02细胞系,再采用实时荧光定量PCR检测ADAR1及相互作用蛋白形成的复合物对mi RNA processing的影响。9.下调ADAR1及相互作用蛋白,采用transwell assay初步探讨二者对肝癌细胞迁移能力的影响:首先采用si RNA技术敲降ADAR1及相互作用蛋白,Western blot检测ADAR1及相互作用蛋白的表达;再采用transwell assay初步研究下调ADAR1及相互作用蛋白后对肝癌细胞迁移能力的影响。结果1.在L02细胞中成功构建ADAR1稳定表达细胞系:通过GV-166载体线性化,引物设计合成,PCR扩增,酶切等过程,测序及PCR鉴定载体正确;质粒载体抽提,共转染293T细胞,得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定病毒滴度为2E+8 TU/ml;在L02细胞中稳定转染ADAR1过表达慢病毒载体,经嘌呤霉素药物筛选,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测细胞中ADAR1的m RNA及蛋白表达水平,结果显示在ADAR1稳定过表达L02细胞中ADAR1表达均比对照细胞高3倍左右,最终获得L02-ADAR1稳定表达细胞系。2.筛选及鉴定ADAR1相互作用蛋白:采用蛋白质组学的方法,获得ADAR1相互作用蛋白,并结合生物信息学分析,找到目标蛋白—RNA解螺旋酶DDX17,再使用Co-IP的方法验证ADAR1与DDX17直接相互作用。利用免疫共定位的方法,发现ADAR1与DDX17在细胞核内存在共定位。3.ADAR1与DDX17在肝癌中的表达:首先采用Western Blot方法对9株肝癌细胞进行ADAR1与DDX17蛋白表达的检测,发现在肝癌细胞中均存在二者的表达,并选定人肝癌细胞MHCC97-H为内源性IP的细胞模型;采用免疫组化的方法,在连续切片中,确认二者均有表达,由于样本量较小,后期我们将扩大肝癌样本量,再进行临床病理特征分析及统计学。4.筛选ADAR1相关差异表达mi RNAs:采用Nano String技术,发现mi RNA共有236个。筛选获得上调的mi RNAs有37个,下调的mi RNAs有45个。结合文献报道及课题研究,我们在下调的45个mi RNAs中挑选出4个目的mi RNAs,即:let-7c-5p,let-7e-5p,mi R-222-3p以及mi R-27a-3p。5.采用si RNA干扰技术,敲降ADAR1/DDX17后,观察二者对mi RNA processing的影响。实时荧光定量PCR结果显示,二者对成熟的mi RNA无明显影响,而对pri-mi RNA及pre-mi RNA的影响我们正在进行深入探讨。6.采用transwell assay,初步研究结果显示下调ADAR1/DDX17抑制肝癌细胞的迁移能力。结论1.成功构建ADAR1过表达慢病毒载体。2.建立ADAR1稳定表达L02细胞系。3.筛选及鉴定ADAR1相互作用蛋白,即DDX17。4.ADAR1/DDX17在细胞核内存在共定位。5.通过内、外源性免疫共沉淀实验方法验证DDX17为ADAR1相互作用蛋白。6.ADAR1/DDX17在肝癌组织及肝癌细胞中存在表达。7.本研究发现ADAR1/DDX17在肝癌中对成熟的mi RNAs合成无明显影响。8.通过transwell assay初步研究发现ADAR1/DDX17促进肝癌细胞的迁移能力。