动脉粥样硬化性疾病严重危害人类健康。泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化发展过程中起着至关重要的作用。所以,有效的阻止泡沫细胞,是防治动脉粥样硬化有效手段。动脉粥样硬化的的严重程度和血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量呈现负相关。HDL-C拮抗动脉粥样硬化的主要机制在于参与胆固醇逆转运(RCT)过程。RCT的定义是,HDL把外周组织中过剩的胆固醇,转运到肝脏,经过代谢后变为胆汁酸排出体外的过程,能够阻止生成泡沫细胞,是较为公认的,防止动脉粥样硬化机制之一。在RCT过程中,细胞内胆固醇、磷脂通过三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)转移给apo A-I,它是HDL前体,新生成HDL,开始RCT过程,所以在RCT和新生成HDL中,ABCA1起着起始和限速作用。如果可以调节ABCA1蛋白的表达,就可以调节RCT,可以调控动脉粥样硬化。Micro RNA(mi RNA)是一类高度保守的,长度一般在22个核苷酸左右,单链形式存在的,非编码的RNA。mi RNA与靶基因m RNA的3’非编码区(UTR)互补结合,在转录后水平直接降解靶基因m RNA或抑制蛋白质翻译。一个靶基因能够被多个mi RNA与其3’UTR特异结合来调控。因此,mi RNA作为一类非常重要的转录后调节因子,与体内代谢、增殖等病理生理过程起着重要作用,了解其详细的调控机制,对疾病的发生和防治非常有意义。最近国内外学者陆续发现多个mi RNA可调控ABCA1。在巨噬细胞、肝细胞和动脉粥样硬化动物模型中,mi R-33、mi R-758、mi R-106b、mi R-27和mi R-19b等mi RNA可与ABCA1靶向结合,起到调节ABCA1的作用和调控动脉粥样硬化的作用,提示mi RNA已成为动脉粥样硬化防治的重要靶点。有研究表明,人动脉粥样硬化腹主动脉瘤组织与人正常血管组织比较,mi R-20a明显升高。临床数据显示,冠心病患者血清中mi R-20a表达较正常健康人群降低。糖尿病患者血清mi R-20b较正常健康者降低。提示mi R-20a/b与动脉粥样硬化、冠心病有着密切的关系,但是mi R-20a/b在动脉粥样硬化发生、发展中的具体机制尚未明了。我们利用生物信息学靶基因预测网站发现,mi R-20a/b序列高度保守,并且mi R-20a/b可与ABCA1的3’UTR靶向结合,并且二者结合自由能较低,提示结合较稳定。ABCA1的3’UTR较长再结合生物信息学预测结果,我们推测:mi R-20a/b可能通过与ABCA1的3’UTR靶向结合,ABCA1的翻译过程受到抑制,使ABCA1蛋白的表达减少,RCT效率降低,促使发生动脉粥样硬化;mi R-20a/b是一个可以对ABCA1起抑制作用新的mi RNA。为验证以上假说,我们拟采用以下方案进行:1、采用荧光素酶报告基因实验分析mi R-20a/b与ABCA1 3’UTR的直接结合作用;2、过表达或沉默THP-1源性、RAW264.7源性泡沫细胞的mi R-20a/b,观察细胞ABCA1表达水平、胆固醇与胆固醇酯含量及胆固醇流出率,离体研究mi R-20a/b对RCT的影响;3、过表达或沉默apo E基因敲除鼠mi R-20a/b,观察对ABCA1表达水平、在体RCT效率、HDL-C水平、动脉粥样硬化斑块面积的影响,在体研究mi R-20a/b对动脉粥样硬化的影响。4、临床研究,比较冠心病患者与正常非冠心病体检者,mi R-20a/b的表达情况。第一部分生物信息学预测和实验验证mi R-20a/b与ABCA1靶向结合目的:生物信息学预测和细胞实验验证,mi R-20a/b与ABCA1靶向结合的情况。方法:在线打开数据库mi RNAbase,输入mi R-20a/b查询其序列。ABCA1的3’UTR序列在Gene Bank中输入查询获得。利用生物信息学在线预测数据库分析mi R-20a/b与ABCA1 3’UTR的结合位点及结合自由能情况。然后进行荧光素酶报告基因实验,首先PCR法扩增THP-1单核细胞ABCA1的3’UTR,然后将野生型ABCA13’UTR或突变型ABCA1 3’UTR重组荧光素酶质粒和mi R-20a/b mimic共转染到293T细胞,最后检测荧光素酶的活性。结果:成功获取mi R-20a/b序列和ABCA1的3’UTR序列。生物信息学分析发现mi R-20a/b序列高度保守,mi R-20a/b的种子序列与ABCA1的3’UTR序列完全配对,并且预测二者结合的自由能低,所预测分数很高。荧光素酶报告基因实验证实,与con mi R组比较,mi R-20a/b可降低野生型ABCA1的3’UTR共转染后荧光素酶活性,而不影响突变型ABCA1的3’UTR共转染后荧光素酶活性。结论:生物信息学预测和荧光素酶报告基因实验证实mi R-20a/b可与ABCA1的3’UTR靶向结合。第二部分mi R-20a/b靶向沉默泡沫细胞ABCA1表达对胆固醇流出的影响目的:离体研究mi R-20a/b对THP-1源性泡沫细胞和RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1 m RNA和蛋白表达,及巨噬细胞胆固醇流出率和细胞内胆固醇含量的影响。方法:利用THP-1单核细胞经PMA分化为巨噬细胞,或常规培养RAW264.7巨噬细胞,然后给予ox-LDL诱导上述巨噬细胞为泡沫细胞。使用Lipo RNAi MAX转染试剂将下述各组干预因素转染至以上两种泡沫细胞,分为以下7组:(1)对照组:正常泡沫细胞组;(2)mimic con组:40n M mimic con培养24h。(3)mi R-20a mimic组:40n M mi R-20a mimic培养24h。(4)mi R-20b mimic组:40n M mi R-20b mimic培养24h。(5)inhibitor con组:40n M inhibitor con培养24h。(6)mi R-20a inhibitor组:40n M mi R-20a inhibitor培养24h。(7)mi R-20b inhibitor组:40n M mi R-20b inhibitor培养24h。检测ABCA1 m RNA和蛋白的表达,使用real-time PCR和western blot法;然后测定THP-1和RAW264.7巨噬细胞内胆固醇流出率,使用液体闪烁仪;高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量。结果:与对照组比较,mi R-20a/b mimic组ABCA1的m RNA和蛋白的表达减少,mi R-20a/b inhibitor组ABCA1的m RNA和蛋白的表达增加,而mimic control和inhibitor control组ABCA1的表达无明显变化。与对照组比较,mi R-20a/b mimic组THP-1源性和RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇流出率降低,细胞内胆固醇含量增加,而mi R-20a/b inhibitor组细胞胆固醇流出率增加,细胞内胆固醇含量降低。结论:mi R-20a/b抑制泡沫细胞ABCA1的表达,减少细胞内胆固醇流出,增加细胞内胆固醇含量,有利于泡沫细胞形成;mi R-20a/b inhibitor可促进泡沫细胞ABCA1表达,增加细胞内胆固醇流出,减少细胞内胆固醇含量,抑制泡沫细胞形成。第三部分mi R-20a/b对apo E-/-动脉粥样硬化小鼠ABCA1的表达及动脉粥样硬化的影响目的:在体研究mi R-20a/b对apo E-/-动脉粥样硬化小鼠ABCA1的表达,及动脉粥样硬化的影响。方法:给予雄性apo E-/-小鼠喂养高脂饮食(21%猪油+0.21%胆固醇)10周造动脉粥样硬化模型,皮下注射化学修饰后mi RNA或anti-mi RNA,分为以下7组:(1)PBS组:给予与mi R-20a等体积的PBS;(2)con mi R组:给予10mg/kg的conrol mi RNA;(3)mi R-20a组:给予10mg/kg的mi R-20a agomir;(4)mi R-20b组:给予10mg/kg的mi R-20b agomir;(5)con anti-mi R组:给予10mg/kg的conrol anti-mi RNA;(6)anti-mi R-20a组:给予10mg/kg的anti-mi R-20a;(7)anti-mi R-20b组:给予10mg/kg的anti-mi R-20a。检测小鼠肝脏ABCA1 m RNA和蛋白的表达,使用real-time PCR和western blot法。腹腔注射3H-胆固醇RAW264.7巨噬细胞,48h后收集小鼠的血清、肝脏及48h粪便,用液体闪烁计数测定RAW264.7巨噬细胞在体胆固醇逆转运效率;酶氧化法检测甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇等血脂水平;检测小鼠主动脉动脉粥样硬化病变程度,使用油红O病理染色和HE病理染色。结果:mi R-20a/b抑制apo E-/-动脉粥样硬化小鼠肝脏ABCA1的m RNA和蛋白的表达,降低小鼠血清、肝脏、粪便的3H-胆固醇含量,使HDL-C水平下降,LDL-C含量升高,最终使得主动脉动脉粥样硬化程度加重;而anti-mi R-20a/b上调apo E-/-动脉粥样硬化小鼠肝脏ABCA1的m RNA和蛋白的表达,增加小鼠血清、肝脏、粪便的3H-胆固醇含量,增加小鼠HDL-C水平,降低LDL-C水平,减轻主动脉动脉粥样硬化病变程度。结论:mi R-20a/b可通过靶向沉默ABCA1的表达,影响血脂水平,加重动脉粥样硬化病变;Anti-mi R-20a/b可促进ABCA1的表达,改善血脂水平,减轻动脉粥样硬化病变,为动脉粥样硬化的治疗提供新的思路。第四部分冠心病患者血清mi R-20a/b的表达及意义目的:研究冠心病患者血清mi R-33和mi R-20a/b的表达情况,初步阐明mi R-20a/b在冠心病患者中的临床意义。方法:收集山西医科大学第二医院心血管内科冠脉造影证实的冠心病患者40例,所有患者无高血压病、无糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L为冠心病组;收集社区正常体检人群,无高血压病、无糖尿病、LDL小于3.12 mmol/L的正常体检人群40例为对照组。采用生化试剂盒检测相关生化指标,用Real time PCR法检测mi R-33和mi R-20a/b的表达。对mi R-33和mi R-20a/b与HDL,LDL进行相关性分析,后进行非条件logistic回归多因素分析mi R-33和mi R-20a/b是否为冠心病独立危险因素。结果:与健康对照组比较,冠心病组吸烟比例和饮酒比例较对照组高,BMI高,而HDL-C低。冠心病组mi R-33和mi R-20a/b表达均降低。对mi R-33和mi R-20/b与HDL-C与LDL-C相关性分析发现,对照组,mi R-33和mi R-20a/b与HDL-C成负相关,但mi R-33无统计学意义,mi R-20a/b有统计学意义。对照组三个mi RNA与LDL相关性均无统计学意义。冠心病组,mi R-33、mi R-20a/b与HDL成正相关,mi R-20a与mi R-33有统计学意义,mi R-20b无统计学意义。冠心病组仅mi R-20a与LDL成负相关,有统计学意义。多因素分析发现,BMI,吸烟,mi R-33和mi R-20a是冠心病的独立影响因素,但吸烟和mi R-33的OR95%可信区间包括了1。结论:冠心病患者mi R-33和mi R-20a/b较正常人降低,mi R-33和mi R-20a/b与HDL相关,可能是冠心病患者的影响因素及临床生物标记物。