具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.nucleatum)是一种革兰氏阴性杆菌,长约5~10μm,专性厌氧,无芽孢,对营养要求高,能够分解氨基酸和多肽,主要代谢产物为丁酸,体外培养时HE染色后镜下可见多个菌体首尾相连呈长短不一的线头样。F.nucleatum在口腔中普遍存在,在牙周病和牙龈炎等口腔疾病的发生中起着重要作用。近期研究显示,除口腔疾病外,F.nucleatum还与炎症性肠病、妊娠并发症相关的宫内感染、早产、新生儿败血症和脓肿等疾病的发生存在密切关联。2012年,Castellarin,M.和Kostic,A.D.等通过全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)发现F.nucleatum在结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)患者的组织中高度富集。目前,F.nucleatum在CRC领域的研究倍受关注。大量研究已证实F.nucleatum在CRC病人的组织和粪便样本中富集,并且与CRC的发生、发展、转移和预后都有着密切的关系;组织和粪便中F.nucleatum DNA含量在CRC临床诊断、治疗方案制定和疗效观察等方面疗中具有重要价值。组织标本中F.nucleatum的量能直接反映其内F.nucleatum的定殖情况,但临床组织标本取材存在有痛有创、操作复杂等问题,相比于组织标本而言,粪便标本取材无创、依从性好。目前检测粪便中F.nucleatum的方法有很多,主要可分为两类,一类为细菌学检验如细菌的分离培养,但从粪便标本中分离培养F.nucleatum十分困难,且耗时长,目前只有少数专业实验室能够实现,不适用于批量样本的检验;另一类为分子生物学方法如宏基因组序列分析、16SrDNA测序技术、数字PCR分析等,但它们都是基于直接提取粪便全基因组DNA进行的,受粪便中其它复杂因素影响较大,且存在检测价格昂贵、耗时长、操作复杂、需要特殊仪器设备等问题。本研究拟采用免疫磁珠(immunomagnetic beads,IMBs)先捕获富集粪便中F.nucleatum,再联合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR),简称(IMBs-qPCR),建立一种定量检测粪便样本中F.nucleatum的方法。该方法具有特异性好、灵敏度高、简便快捷、成本低等特点,可实现粪便样本中F.nucleatum的快速定量检测,以期在CRC早期诊断、临床诊疗和预后评估等方面有一定的临床应用价值。【研究目的】建立免疫磁珠捕获联合实时荧光定量PCR(IMBs-qPCR)检测粪便样本中F.nucleatum的实验方法,为临床标本中F.nucleatum的定量检测提供方法学基础。【研究方法】1.F.nucleatum qPCR反应体系的建立与评价(1)根据F.nucleatum特异性保守基因NusG设计并合成qPCR引物和含目的基因的标准阳性质粒。(2)温度梯度qPCR反应优化引物退火温度,以浓度梯度引物进行qPCR反应优化反应体系中引物工作浓度。(3)以F.nucleatum和其它细菌基因组DNA为模板进行qPCR反应,验证引物特异性。(4)以梯度稀释阳性质粒为模板进行qPCR反应,绘制qPCR标准曲线。2.捕获具核梭杆菌的免疫磁珠制备与评价(1)0.4%甲醛灭活并固定F.nucleatum菌体制备颗粒性抗原,F.nucleatum颗粒性抗原经耳缘静脉多次注射免疫新西兰兔制备F.nucleatum多克隆抗体血清。ELISA和凝集法检测F.nucleatum多克隆抗体效价,免疫荧光法验证抗体与F.nucleatum的结合能力。(2)盐析法和亲和层析法纯化F.nucleatum多克隆抗体,BCA法测定纯化后多克隆抗体浓度,SDS-PAGE验证纯化后多克隆抗体。(3)不同pH的活化缓冲液活化免疫磁珠,将活化后的免疫磁珠与抗体偶联,用BCA法检测免疫磁珠偶联抗体的量,根据不同条件下单位免疫磁珠偶联抗体的量确定活化缓冲液的最佳pH。在不同的温度和时间条件下进行免疫磁珠与多克隆抗体的偶联反应,用BCA法检测免疫磁珠偶联抗体的量,根据不同条件下单位免疫磁珠偶联抗体的量确定免疫磁珠与多克隆抗体偶联的最佳温度和时间。用不同量的多克隆抗体与免疫磁珠进行偶联,根据单位磁珠偶联抗体的量确定多克隆抗体与免疫磁珠的最佳比例。用免疫磁珠捕获F.nucleatum,提取捕获后F.nucleatum基因组DNA进行qPCR反应,根据捕获效率确定免疫磁珠捕获F.nucleatum的最佳温度和时间。(4)采用不同量的免疫磁珠捕获F.nucleatum,根据捕获效率确定免疫磁珠的最佳使用量。3.IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum方法的建立与评价(1)收集F.nucleatum阴性的人粪便标本,添加不同浓度F.nucleatum制备模拟标本。(2)IMBs-qPCR检测不同样本中的F.nucleatum,分析免疫磁珠捕获F.nucleatum的效率。(3)IMBs-qPCR和粪便全基因组提取试剂盒联合qPCR检测含不同浓度F.nucleatum的模拟标本,确定其最低检测限,并绘制ROC曲线。(4)IMBs-qPCR检测含低、中、高浓度F.nucleatum的样本,评价IMBs-qPCR方法的一致性。【研究结果】1.F.nucleatum qPCR反应体系的建立与评价(1)根据F.nucleatum特异性保守基因NusG设计并合成了qPCR引物和含目的基因的标准阳性质粒PUC 57-NusG。(2)优化了引物的退火温度和工作浓度,其最佳退火温度为57℃,最佳引物工作浓度为400 nM。(3)验证了F.nucleatum qPCR反应引物的特异性,结果显示,仅实验组(F.nucleatum基因组DNA组)有目的基因的扩增,表明其引物特异性良好。(4)绘制了标准阳性质粒qPCR反应标准曲线,标准曲线方程为Log Copies=11.033-0.2931 Ct,R~2=0.998,E=96.70%。2.捕获具核梭杆菌的免疫磁珠制备与评价(1)制备了F.nucleatum颗粒性抗原和兔抗F.nucleatum多克隆抗体。优化了ELISA检测F.nucleatum多克隆抗体效价的包被抗原类型和浓度,其最佳包被抗原类型为全菌抗原,浓度为10~6 CFU/孔;ELISA检测多克隆抗体效价约为320 000,凝集法检测多克隆抗体效价约为800;免疫荧光法实验表明制备的多克隆抗体能特异性地结合F.nucleatum。(2)经盐析法纯化后抗体浓度为11.32±0.27 mg/mL,IgG纯度约为60%。(3)免疫磁珠活化缓冲液的最佳pH为5.0;免疫磁珠与多克隆抗体偶联最佳温度为25℃,时间为2.5 h;多克隆抗体与免疫磁珠的最佳比例为10μg/mg;免疫磁珠捕获F.nucleatum的最佳温度为37℃,时间为40 min。(4)当F.nucleatum浓度为10~4 CFU/mL时,免疫磁珠的最佳使用量为1.0 mg。3.IMBs-qPCR检测方法的建立与评价(1)当样本中F.nucleatum浓度为10~2 CFU/mL、10~3 CFU/mL、10~4 CFU/mL、10~5CFU/mL时,免疫磁珠在纯培养菌悬液中的捕获效率分别为36.31±2.10%、35.45±1.31%、65.70±1.31%、55.73±1.60%;在模拟粪便标本中捕获效率分别为17.96±2.13%、17.81±3.71%、26.85±2.44%、21.07±2.13%;在含不同浓度F.nucleatum的样本中,免疫磁珠对模拟粪便标本中F.nucleatum的捕获效率约为其对纯培养菌悬液中F.nucleatum的捕获效率的50%。(2)在检测粪便样本中F.nucleatum时,IMBs-qPCR的最低检测限可达100CFU/200 mg,其灵敏度是粪便全基因组DNA提取试剂盒联合qPCR法(400 CFU/200mg)的4倍;ROC曲线结果显示,IMBs-qPCR的检测效能(AUC=0.948)也比粪便全基因组DNA提取试剂盒联合qPCR法(AUC=0.878)高。(3)IMBs-qPCR检测含低、中、高三种不同浓度F.nucleatum的模拟粪便时,其批内和批间CV%均小于5%。【主要结论】1.建立了F.nucleatum qPCR反应体系和标准曲线。2.制备并纯化了能满足实验要求的兔抗F.nucleatum多克隆抗体。3.优化了免疫磁珠活化与偶联多克隆抗体的反应条件,以及免疫磁珠捕获F.nucleatum的反应条件。4.建立了IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum的实验方法。【研究意义】本研究建立了IMBs-qPCR检测粪便中F.nucleatum的实验方法,该方法具有特异性好、敏感性强、价格低、简便快捷的特点,能快速定量检测粪便中F.nucleatum,为F.nucleatum在CRC临床早期诊断、疗效评价和预后评估等方面的应用提供了技术基础,具有潜在临床应用的价值。