低温、干旱及高盐等非生物逆境是影响植物生长发育的重要限制因素,严重时甚至导致植物死亡,在农业生产中危害极大。低温冻害可能造成植物细胞机械损伤,引起细胞膜的膜脂相变。干旱和盐害都属于渗透胁迫,干旱会引起细胞失水,严重时会导致死亡;盐害会导致植物生长被抑制、光合作用下降以及活性氧积累等不利影响。研究植物对非生物逆境的应答机制,提高植物对逆境的抗性一直是植物科学领域的研究热点。植物中存在一个以CBF结合因子(C-repeat/dehydration-responsive element binding factor)为主导的低温和脱水响应通路,在植物低温响应的基因调控网络中占有核心地位。CBFs类转录因子是一类在植物中特异存在的、在干旱或低温等非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。该类转录因子能特异性识别DRE/CRT(dehydration responsive element/C-repeat)顺式元件,并能与DRE/CRT顺式元件相结合,从而激活下游一系列响应干旱、高盐和低温等抗逆基因的表达。因此,转录因子在植物生长发育,信号转导和功能基因的表达调控中起到重要作用。甘蔗(Saccharum ofcinrum)是世界上最主要的糖料作物和能源作物。我国甘蔗立地条件差,85%以上种植在旱坡地,土壤瘠薄、无灌溉条件,干旱是我国甘蔗生产的主要限制因素,另外,由于连年种植,病虫害严重,近年来,灾害性天气特别是低温冻害频发,严重威胁我国甘蔗生产。因此,研究甘蔗响应多种逆境胁迫的机理,对于筛选、培育抗逆甘蔗品种和材料具有重要的理论意义和应用价值。本研究通过同源克隆技术,从甘蔗中分离获得CBF1基因的全长cDNA序列。应用生物信息学软件,对CBF1基因所编码的蛋白结构及其功能进行预测分析。同时,利用实时荧光定量PCR技术,分析了甘蔗CBF1基因在甘蔗上的组织表达特性以及在不同逆境胁迫下的表达模式。进一步利用农杆菌介导转化法,将CBF1基因导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)中,研究该基因的在烟草中的瞬时表达效应。研究结果为揭示甘蔗CBF1基因的功能以及在甘蔗抗逆育种上的应用奠定基础。本研究主要取得以下进展:1.甘蔗ScCBF1基因cDNA全长序列克隆与分析利用生物信息学和 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法从甘蔗中克隆到1个新的CBF类基因,命名为ScCBF1。该基因的开放读码框(open reading frame,ORF)长度为603 bp,编码200个氨基酸,编码蛋白相对分子质量为22.80 kD,理论等电点为10.31。氨基酸序列比对结果表明,ScCBF1与高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zeamays)中该蛋白相似度分别是96%和94%。进化分析表明ScCBF1与高粱的亲缘关系最近。2.甘蔗ScCBF1基因的表达模式分析qRT-PCR表达分析结果表明,ScCBF1在甘蔗根、茎、叶中均有表达,但在根中表达量最高。ScCBF1在低温、干旱、脱落酸(ABA)胁迫下诱导表达,而高盐抑制ScCBF1的表达。3.甘蔗ScCBF1基因的原核表达分析成功构建了带有CBF1基因的原核表达载体pGEX-6P-1-ScCBF1,经IPTG诱导,在大肠杆菌(E.coli)表达菌株Rosetta(DE3)细胞中,得到目的融合蛋白,其分子量为44.80 kDa。重组质粒pGEX-6P-1-ScCBF1与空载pGEX-6P-1生长曲线结果表明,这两种细胞的生长曲线没有明显变化。4.瞬时表达ScCBF1诱发本氏烟的防御反应构建植物超表达载体pCAMBIA-1301-ScCBF1,通过农杆菌介导法侵染烟草,观察T0代烟草植株表型,其结果为进一步探究ScCBF1在烟草中过表达对植物抗逆性的研究奠定基础。本文研究结果初步确定了甘蔗ScCBF1基因的功能及表达模式,为甘蔗抗逆育种或遗传改良提供了实验证据依据。