一、研究背景肝功能衰竭是各种肝脏疾病的终末期状态,死亡率极高,是目前肝脏疾病治疗的难点。近年来人工肝、组织工程等技术有了较大的突破,但这些技术仍有较大的局限性,生物人工肝的临床疗效有限,而组织工程技术又短时难以应用于临床。目前肝脏移植是治疗肝衰竭的唯一有效手段,但由于存在供体短缺、价格昂贵、免疫排斥等不足,难以广泛开展。由于肝脏具有极强再生能力,在受到各种理化损伤后能通过自身的再生修复受损的肝脏组织和细胞,因此有效刺激肝脏自身的合理再生被认为是治疗肝脏功能衰竭的理想手段。对于肝脏外科而言,肝切除术(partial hepatectomy,PH)被广泛应用于各种肝脏外科良恶性疾病的治疗[1],而过多地切除肝脏组织也易导致术后肝功能衰竭。在肝切除术后,成熟肝细胞可以在一系列精密调控的情况下[2],通过增生和增殖进行肝再生[3]。如果能够增强肝脏本身的再生能力,并给予适当的约束和调控,将对肝功能衰竭的防治提供巨大的帮助,为肝脏外科医生开展更大范围的肝切除提供有力的支持。因此,研究肝切除术后的肝脏再生调控网络对于理解肝再生过程、防治肝衰竭具有非常重要的意义[4]。Tmub1(transmembrane and ubiquitin like domain containing 1)是一个包含泛素样结构域和跨膜结构域的核质穿梭蛋白。研究发现,在肝再生过程中,Tmub1迅速出核并高表达,发挥负向调控肝细胞增殖的作用[5],但目前对于Tmub1负向调控肝再生的机制仍缺乏了解。课题组通过前期研究发现,securin可能是Tmub1的下游靶蛋白之一[6]。Securin即分离酶抑制蛋白,在细胞周期调节中发挥了重要的作用。在有丝分裂结束之前securin必须经过泛素化-蛋白酶体途径降解,才能使细胞顺利完成姐妹染色单体的分离[7]。有研究表明,在内质网相关的蛋白降解通路(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)中,Tmub1可以与gp78和SPFH2形成复合体,介导HMG-Co A还原酶的泛素化[8],因此,Tmub1有可能通过参与securin的泛素化降解过程来影响肝细胞的增殖。但是,Tmub1参与泛素化的现象和机制仍报道极少,而且目前人们对泛素样蛋白的功能还没有统一的认识,该类蛋白也可能通过非泛素化途径发挥作用。因此,具体的作用机制需深入研究,Tmub1的泛素样结构域(UBL)是否能直接或间接地参与泛素化调控也需要进一步明确。二、研究目的1.利用大鼠70%肝切除模型,明确Tmub1和securin的m RNA和蛋白水平在肝再生全程中的表达规律及相关性。2.进一步明确Tmub1对大鼠正常肝细胞增殖能力、细胞周期和有丝分裂的影响。3.明确Tmub1对securin泛素化调控过程的影响,并初步探索Tmub1的泛素样结构域(UBL)在securin泛素化过程中的作用。三、材料和方法1.通过构建大鼠70%肝切除再生模型,采用RT-q PCR和Western Blotting技术检测Tmub1和securin在肝再生过程中的表达规律。2.分别构建Tmub1过表达和sh RNA干扰的慢病毒载体,分别感染大鼠正常肝细胞系BRL-3A并建立稳定感染细胞株,通过CCK-8、Ed U、流式细胞术等方法检测Tmub1表达对BRL-3A细胞增殖能力及细胞周期的影响。3.采用细胞周期同步化和免疫荧光技术,观察Tmub1过表达对BRL-3A细胞有丝分裂过程的影响,并使用Western Blotting检测有丝分裂进程中cyclins(细胞周期素蛋白)的表达量。4.使用免疫沉淀、Western Blotting、RT-q PCR检测Tmub1表达对securin的表达及其泛素化水平的影响。5.构建Tmub1的UBL结构域突变体和截断体质粒载体,检测UBL结构域突变或缺失后的Tmub1对securin泛素化水平的影响。6.实验数据均采用SPSS 19.0统计软件进行分析,使用Graph Pad Prism 6.0软件绘制统计图;计量资料结果以均数±标准差表示,采用t检验进行两组间均数比较,单因素方差分析与LSD法进行多组间均数比较。P<0.05作为显著统计学差异的标准。四、结果1.Tmub1的m RNA和蛋白水平在大鼠70%肝切除术后均先升高,在术后24~48h达到高峰后降低;securin的m RNA和蛋白表达趋势不一致,其m RNA水平在手术12h后逐渐增加,在术后48h达到高峰后逐渐降低,而其蛋白水平在术后逐渐降低,术后48h最低,至术后7d恢复较高水平;Tmub1表达水平和securin m RNA水平在时间上呈正向相关,和securin蛋白水平在时间上呈负向相关。2.增强Tmub1表达可使BRL-3A细胞增殖能力降低,而抑制Tmub1表达则导致BRL-3A细胞增殖能力增强。Tmub1过表达可显著增加G1期的细胞比例,降低S及G2/M期的细胞比例,而抑制Tmub1表达则可显著增加S期细胞比例,降低G1期细胞比例。3.Tmub1过表达可影响BRL-3A细胞有丝分裂期进程,并影响cyclins在M期的表达水平。其中,在阴性对照组BRL-3A细胞中,cyclin A和cyclin B1的表达量在有丝分裂第0.5h时即明显降低,而在Tmub1过表达组中,cyclin A和cyclin B1的表达在1.5h时都仍维持较高水平。4.过表达或干扰Tmub1对securin基因转录水平无明显影响,但可影响其蛋白表达水平:过表达Tmub1可明显增加securin蛋白表达,干扰Tmub1可明显降低securin蛋白表达。5.Tmub1过表达可下调securin的泛素化水平,抑制Tmub1表达可增加securin的泛素化水平。6.Tmub1的UBL结构域突变体和截断体均不能引起securin泛素化水平的改变。BRL-3A细胞转染UBL结构域突变体质粒后,securin泛素化水平与阴性对照组无明显差异;转染UBL结构域截断体质粒后,securin泛素化水平与阴性对照组也无明显差异。五、结论Tmub1在肝再生过程中的表达具有明显的规律性,可抑制肝细胞增殖并影响细胞周期进程。Tmub1可通过其UBL结构域抑制securin的泛素化,从而影响肝细胞有丝分裂。因此,Tmub1在肝再生中可能作为一个重要的负向调控因子发挥了精确调控的作用。