论文部分内容阅读
研究背景及目的:全新的围术期神经认知功能障碍（PND）概念涵盖了术前已经出现、术后三十天之内、术后三十天至术后一年出现的所有的认知功能障碍。术后认知功能障碍（POCD）,是老年患者手术后常见的中枢神经系统的损伤,且发生率随着年龄的增长逐渐增高,尤其是接受过外科大手术的患者。POCD发生后具有以下特点:病情起伏较大且易反复、自身认知能力大幅度下降、记忆功能衰退、生活及工作能力降低和患者情绪性格出现较大的变化,病情严重者可能出现患者人格变动。老年患者发病率明显高于年轻患者,这对处于老龄化的中国来说是一个极大的挑战。POCD患者因上述临床表现往往会增加在医院就诊住院时长、扩大当前相应的医疗资源缺口、增添家庭及社会医疗支出。这不仅严重影响患者日后生活自由和品质,也增添了患者家庭经济压力和社会医疗支出。目前POCD发病机制尚未有准确公认的诠释,并且发病因素复杂多样,主要研究方向是脑部海马组织中枢神经炎症。目前药物治疗POCD主要通过三种途径,分别是抗炎途径、抗氧化途径和保护神经元途径。右美托咪定（Dex）是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,手术中用作镇静剂和辅助剂,在重症监护室中用作镇定剂。通过与α2受体的结合使蓝斑神经元超极化抑制去甲肾上腺素释放。Dex治疗POCD的途径主要是保护神经元和抗炎作用。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200nt的非编码RNA。lncRNA在脑部及神经疾病中发挥不可缺少的作用,参与神经信号传递、脑功能与发育和神经退行性疾病。有研究表明,lncRNA可通过影响Aβ蛋白参与调节阿尔茨海默症;可通过影响神经元突触功能和树突发育调节学习和记忆能力;还可调节促炎因子表达改善脑部海马区的炎症情况。POCD患者出现空间学习和记忆能力的改变,大脑海马区可能存在炎症因子的改变及组织的形态学改变,大脑海马区lncRNA可能也存在着特异性改变。Dex可能通过影响大脑海马区lncRNA表达达到治疗POCD的目的。第一部分右美托咪定对POCD动物模型的影响研究目的:观察右美托咪定对POCD动物模型的治疗作用。研究方法:本实验通过脾切除手术建立老年大鼠POCD模型,水迷宫实验检测大鼠空间记忆和学习能力;HE染色观察大鼠海马组织形态;qRT-PCR检测大鼠海马组织TNF-α和IL-1β的表达。1.POCD动物模型的建造:18月龄SD大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后进行脾切除术,Dex组术前腹腔注射Dex,其他组为生理盐水。2.水迷宫实验:构建实验平台,训练大鼠探索平台,训练完成后检测相关指标。3.H&E染色:利用苏木精和伊红对大鼠海马组织切片进行染色。4.qRT-PCR:提取大鼠海马组织总RNA后检测海马组织中目的基因的表达。研究结果:1.术前30分钟给与Dex后,降低了POCD大鼠的逃避潜伏期和增加了穿过平台的次数。2.POCD大鼠海马区中更多的神经元具有明显的核仁结构和略微稀疏且相对规则的排列。此外,神经元细胞核染色较浅,但是无明显的核固缩。3.显著下降POCD大鼠海马组织TNF-α和IL-1β。第二部分大鼠海马组织全转录组测序及分析研究目的:观察右美托咪定治疗后大鼠海马组织mRNA和lncRNA表达变化情况。研究方法:本实验通过对大鼠海马组织进行全转录组测序,确立并分析表达量有明显差异的mRNA和lncRNA。并通过GO与KEGG方法分析预测差异表达mRNA和lncRNA功能和信号通路。qRT-PCR在海马组织中验证测序结果。1.全转录组测序:提取Dex和POCD组大鼠海马组织总RNA,去除rRNA后反转录合成cDNA,经过片段分选,PCR富集后上机测序。测序获得的原始数据进行质量检测,GO与KEGG方法分析Dex和POCD组差异表达的mRNA和lncRNA的功能。2.RNA提取及qRT-PCR检测:提取大鼠海马组织总RNA,通过qRT-PCR检测海马组织五个lncRNA（LOC103692676、LOC102546895、LOC100911992、Ncl-ps1和LOC103692397）的表达情况。研究结果:1.Dex与POCD组海马组织mRNA及lncRNA差异表达明显,它们参与生命进程主要依靠NF-κB和p53信号通路。2.PCR表明测序结果数据可靠。第三部分lncRNA-LOC102546895在小胶质细胞中功能研究研究目的:在小胶质细胞中观察LOC102546895承担的细胞功能,主要是观察LOC102546895对细胞增殖、凋亡和记忆关键基因NPAS4表达的影响。研究方法:本实验通过siRNA敲低小胶质细胞中LOC102546895;CCK8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;WB和qRT-PCR技术检测NPAS4蛋白和mRNA表达水平。1.细胞增殖检测:细胞转染后用CCK-8处理,酶标仪检测OD值,观察细胞增殖活力。2.细胞凋亡检测:将对照组细胞与转染细胞收集,加入凋亡染色液后上机流式检测。3.NPAS4表达检测:提取总蛋白,通过WB和qRT-PCR方法检测NPAS4表达水平。研究结果:1.敲低LOC102546895表达后,小胶质细胞的增殖能力显著增强。2.敲低LOC102546895表达后,小胶质细胞细胞凋亡显著减少。3.敲低LOC102546895表达后,小胶质细胞的NPSA4表达明显减少。结论1.Dex可明显改善POCD引起的空间学习记忆障碍,降低海马组织中IL-1β和TNF-α表达。2.测序结果显示,Dex与POCD组海马组织mRNA及lncRNA差异表达明显,主要在NF-κB和p53信号通路上差异明显,表明Dex可能通过NF-κB和p53信号通路达到治疗POCD的目的。3.在敲低LOC102546895的小胶质细胞中,显著提升细胞增殖能力并显著降低细胞凋亡和NPAS4基因的表达。