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天花粉蛋白(TCS)是传统中药天花粉的主要活性成分,属I型核糖体失活蛋白,具抗肿瘤活性。研究发现,TCS在体内的穿膜途径由低密度脂蛋白相关受体蛋白l(Low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP 1)介导,对不表达 LRP 1 受体蛋白的很多细胞则穿膜作用受限,因此限制了 TCS在抗肿瘤治疗上的使用。穿膜肽(CPP)是一类能够将不能自主跨越细胞膜的货物分子(蛋白、核酸等)输送进入细胞内部的的短肽,可用于体内的药物运输。本课题组先前开发的一种来源于人超氧化物歧化酶C端的穿膜肽HBD具有高效的穿膜能力。本研究首先克隆表达了重组TCS,经体外细胞实验证实其具有抑制HeLa细胞增殖的活性。然后采用将人源性穿膜肽HBD与TCS基因融合的方式,以基因重组技术构建了 pET28b-TCS-HBD表达载体,转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株进行表达,通过His标签,经Ni+-NTA亲和层析,成功制备了纯化的重组TCS-HBD融合蛋白。实验结果显示,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的TCS-HBD融合蛋白穿膜效率明显高于没有融合CPP的TCS,表明穿膜肽HBD有效促进了 TCS跨过细胞膜进入细胞的能力。重组TCS和TCS-HBD融合蛋白对HeLa细胞进行的MTT实验结果显示:融合穿膜肽的TCS-HBD蛋白抑制HeLa细胞生长的IC50为38 μg/mL,而在相同条件下,没有融合HBD的TCS对HeLa细胞生长抑制率未达到50%,其IC5G值超过120 μg/mL,说明CPP大大提高了 TCS进入肿瘤细胞的能力,增强了 TCS的抗肿瘤活性。流式凋亡分析、DNAladder检测及细胞核形态观察表明,TCS-HBD融合蛋白诱导了 HeLa细胞的凋亡。TCS-HBD作用肺癌细胞A549结果也表明穿膜肽对TCS的细胞毒性明显提高。本课题首次将穿膜肽引入TCS,显著提高了 TCS对于HeLa细胞的穿膜能力。与没有融合穿膜肽的TCS相比,TCS-HBD蛋白抑制HeLa细胞生长的有效药物浓度明显下降,提高了其抗肿瘤活性,本文研究成果拓展了 TCS在抗肿瘤研究中的应用价值。此外,为了保证融合蛋白中穿膜肽和TCS各自发挥独立的生物学功能,本文对人源性穿膜肽和TCS融合的连接方式进行了研究,通过对示踪蛋白EGFP荧光强度的检测和穿膜肽穿膜效率观察,考察了不同的连接肽对融合蛋白功能的影响,结果表明柔性连接肽可以有效地发挥穿膜肽和EGFP的活性,为穿膜肽和运输药物蛋白的连接方式选择提供了重要依据。