β-磷酸三钙对成骨细胞基因表达的影响及骨粘连蛋白的纯化

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钙磷可降解生物医用材料在医学领域上有着重要的研究和应用前景,尤其在骨修复、骨替代、药物释放载体等医学领域都有着重要的应用。因此,探讨Ca、P生物陶瓷材料在体内参与有生命组织过程的机制成为近年来研究者所关注的重点。本文主要从生物学和分子生物学的角度来探讨钙磷降解材料参与构建有生命组织的机制,开展钙磷降解材料生物矿化的生物学。在本实验中,分别用组织块法和酶消化方法从Wister新生乳鼠的颅骨中分离了成骨细胞,并对所获得的细胞用差速贴壁方法进行纯化,并进行碱性磷酸酶染色和钙结节染色,染色后的结果证明两种方法所获得的成骨细胞具有良好的生物学特性。在对同一批组织块进行连续培养时,发现将同一批组织块法进行连续培养后均可获得细胞形态良好的成骨细胞,碱性磷酸酶染色显示有高的碱性磷酸酶活性。证明连续组织法培养的成骨细胞生物学特性良好,确保了实验的一致性,而为后面的进一步的深入研究提供大量的种子细胞。将成骨细胞和钙磷降解材料混合培养后,显微镜下观察可以发现成骨细胞对β-TCP颗粒有明显的吞噬作用。同时MTT实验分析表明,β-TCP有利于成骨细胞的生长和增殖。将成骨细胞和β-TCP颗粒混合培养一段时间以后,提取成骨细胞的总RNA,运用RT-PCR、PCR手段来检测钙磷材料对成骨细胞相关基因表达水平的影响。合成并设计成骨细胞相关基因的引物,RT-PCR、PCR方法检测结果显示,β-TCP颗粒可以显著促进成骨细胞中与成骨作用相关的基因,如碱性磷酸酶(ALP)mRNA、骨粘连蛋白(ONN)mRNA的表达。由于β-TCP能促进成骨细胞骨粘连蛋白mRNA表达。因此,为了探讨骨相关蛋白在矿化过程中的作用,将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pET28a中,构建了可以表达ONN的pHX201/ONN表达载体。同时将本中心已经构建的大鼠骨粘蛋白表达载体pGEX-KG2/ON,以及新构建的pHX201/ONN表达载体分别插入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLyS和R1L菌中进行诱导表达,结果发现pGEX-KG2/ON表达载体比pHX201表达载体更有利于骨粘蛋白的表达。并进一步对pGEX-KG2/ON表达载体的表达和纯化条件进行优化,将含有pGEX-KG2/ON表达载体的细菌进行扩增,并将增菌后的菌液通过离心、细菌破碎、硫酸铵分级沉淀、超滤管分离、GST亲和层析柱层析逐步纯化,获得了纯度较高GST融合蛋白。
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