【摘 要】
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研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治疗的异质性,所以深入研究难治性DLBCL的分子机制极其重要。弥漫大B细胞淋巴瘤预后与LDH生化指标密切相关,而在弥漫大B细胞淋巴瘤
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研究背景和目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成人最常见的非霍奇金淋巴瘤,在R-chop方案治疗后,60%的患者得到完全缓解或部分缓解,但仍有40%因肿瘤复发与耐药而最终死亡。同时弥漫大B细胞淋巴瘤有临床治疗的异质性,所以深入研究难治性DLBCL的分子机制极其重要。弥漫大B细胞淋巴瘤预后与LDH生化指标密切相关,而在弥漫大B细胞淋巴瘤中鲜有报道代谢方面的具体机制及应用。Fbw7（F-box and WD repeat domain containing 7）基因属于F-box蛋白家族,定位于人4号染色体（4q31.3）,该家族还包括含WD-40结构域的F-box,包含富亮氨酸重复序列的F-box和包含不同蛋白质-蛋白质相互作用模块或无可识别基序的F-box。新近的研究显示Fbw7在多种癌症中起不同的作用,提示其可能在不同癌症的发生发展中承担重要作用。在DLBCL中,我们的前期研究已证实泛素连接酶Fbw7调控细胞凋亡在弥漫大B细胞淋巴瘤中发挥重要作用,但是其在代谢方面是否也起到作用目前仍不清楚。本研究旨在通过分子病理学及分子生物学方法,结合体内外功能研究,阐明Fbw7在弥漫大B细胞淋巴瘤中的代谢作用及其相关分子机制,为深入理解弥漫大B细胞淋巴瘤发病机理提供新的理论思路。研究方法:1.用蛋白印迹检测,瞬时转染Fbw7的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞后LDHA、HK2、LUT-1、PDK1等代谢分子蛋白的变化和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）验证Fbw7与LDHA的相互作用,通过泛素化、蛋白降解实验评估Fbw7对LDHA的调控作用,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估过表达Fbw7对代谢功能的作用。2.调整SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞外乳酸浓度,用蛋白印迹实验检测后Fbw7、LDHA和p Y10-LDHA的变化,用Micro RNA荧光定量PCR法检测miR-223含量变化。3.用蛋白印迹检测,瞬时转染miR-223的SU-DHL-2、OCI-LY-10肿瘤细胞干扰Fbw7后,LDHA和磷酸化的p Y10-LDHA的变化,通过细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测等方法,评估干扰Fbw7对代谢功能的作用。4.用细胞外乳酸脱氢酶检测、ATP产量检测方法检测,干扰LDHA的U2932、SUDHL-2肿瘤细胞后,弥漫大B细胞淋巴瘤代谢功能。5.用NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷）小鼠,注入一定量的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞,分别使用miR-223模拟物、miR-223抑制剂及LDHA干扰片段,评估肿瘤增长情况。6.提取R-CHOP治疗后复发及非复发的DLBCL肿瘤样品组织的RNA,通过Micro RNA荧光定量PCR法测定miR-223含量。研究结果:1.过表达Fbw7可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力,机制研究发现,Fbw7能够通过调控LDHA的泛素化降解,使LDHA、磷酸化的p Y10-LDHA明显下调。2.糖酵解最终产物乳酸抑制Fbw7表达,促进LDHA、p Y10-LDHA的表达,并诱导miR-223的表达。3.瞬时转染miR-223可明显抑制Fbw7表达,同时抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。4.干扰LDHA可明显抑制抑制弥漫大B细胞淋巴瘤代谢能力。5.体外实验miR-223激动剂能够促进弥漫大B细胞淋巴瘤皮下成瘤,而miR-223抑制剂及LDHA干扰片段抑制DLBCL细胞皮下成瘤。6.miR-223在治疗后复发DLBCL肿瘤样品中表达水平显著高于治疗缓解患者。研究结论:在弥漫淋巴大B细胞淋巴瘤中,Fbw7可通过调控LDHA的泛素化从而抑制有氧糖酵解通路的激活,并受LDHA催化产物乳酸调控,而乳酸则具体通过miR-223调控Fbw7,在肿瘤中代谢环境形成正反馈机制。
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