遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegia,HSP)是一种在临床上较为罕见的神经系统退行性疾病,具有明显的遗传和临床异质性。其主要临床症状为对称性双侧下肢渐进性肌无力和肌张力增高。病理学变化包括轴索变性和脱髓鞘,并可伴有神经元缺失等改变。有关HSP的发病机制目前尚不明确,因此确定HSP的致病基因并对其功能进行研究就成为探索HSP发病机制及防治的关键。截至目前,已有70余个HSP致病基因位点和59个致病基因被确定。其中,SPG42致病基因SLC33A1是由本课题组利用连锁分析的方法从一例青岛地区HSP家系中发现的。通过突变分析发现该家系患者SLC33A1基因第339位胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,引起SLC33A1蛋白第113位丝氨酸被精氨酸替代,此种错义突变导致HSP发病。为了更加有效的研究SLC33A1基因错义突变引起遗传性痉挛性截瘫的作用机制,本课题小组构建Slc33a1S113R错义突变(Slc33a1S113R)基因敲入小鼠模型。前期研究发现,杂合子小鼠(Slc33a1wt/mut)能正常存活,而纯合子小鼠(Slc33a1wt/wt)在胚胎发育早期便死亡。这表明SLC33A1蛋白对Slc33a1S113R基因敲入小鼠早期胚胎发育至关重要。此外,我们对Slc33a1wt/mut突变小鼠脊髓灰质区进行透射电镜检查,结果显示Slc33a1wt/mut突变小鼠神经细胞超微结构异常,出现退行性病变。尤其是线粒体,出现肿胀、局部空化、嵴缺失等形态异常。上述结论提示我们Slc33a1基因对线粒体的形态及功能维持具有重要作用。因此,我们利用SPG42患者及对照正常人的皮肤成纤维细胞,高表达野生型及突变Slc33a1的HeLa细胞,体外培养野生型和Slc33a1S113R基因敲入小鼠大脑皮层神经元细胞,研究Slc33a1S113R错义突变对线粒体表型的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。线粒体作为细胞内的"动力工厂",是机体内最主要的能量供应者,可以为体内神经元细胞正常生命活动持续稳定的提供能量,因此确保线粒体结构和功能正常对神经元存活至关重要。线粒体多呈短棒状、粒状或者线状,而Slc33a1wt/mut突变小鼠脊髓灰质区透射电镜结果显示神经元和神经胶质细胞中线粒体出现肿胀、局部空化和嵴缺失等形态异常。另外,从体外细胞水平上,对培养6天的小鼠大脑皮层神经元细胞进行轴突特异性标记物Tau蛋白免疫荧光染色,结果发现Slc33a1wt/mut突变小鼠大脑皮层神经元部分轴突发生肿胀。同时向大脑皮层神经元细胞内转染线粒体表达载体pDsRed2-Mito,观察发现Slc33a/mut突变小鼠大脑皮层神经元细胞中部分轴突肿胀是由于线粒体堆积造成的。随后,对两种基因型神经元细胞轴突中线粒体运输能力进行检测,发现Slc33a1wt/mut突变小鼠大脑皮层神经元细胞线粒体的运输能力出现了明显下降,这说明Slc33a1S113R错义突变对线粒体的影响在单细胞水平就能发生,并且是影响线粒体在神经元轴浆中的运输,造成了线粒体的堆积,进而影响线粒体对神经元细胞的能量供应。但是通过大脑皮层神经元细胞a-Tubulin免疫荧光染色,并未发现二者的细胞骨架有明显异常。说明Slc33a1S113R错义突变不是通过影响细胞骨架进而影响轴浆运输的。在体内实验中,我们向小鼠腓肠肌注射霍乱毒素B亚单位(Cholera Toxin B Subunit.CTB),对小鼠体内逆行轴浆运输能力进行检测。结果发现Slc33a1wt/mut突变小鼠轴浆内物质逆行性运输出现异常。此外,我们利用JC-1荧光探针检测了不同基因型细胞的线粒体膜电位水平。发现与对照组相比,Slc33a1wt/mut突变小鼠大脑皮层神经元细胞和SPG42患者皮肤成纤维细胞中线粒体膜电位水平明显低于对照组,证明了Slc33a1S113R错义突变能够导致线粒体功能发生异常。另外,我们还对不同基因型细胞中ATP浓度进行了检测。发现与对照组相比,SPG42患者皮肤成纤维细胞的ATP浓度明显降低,说明Slc33a1S113R错义突变导致线粒体ATP合成能力受到影响。为了进一步探究SLC33A1是如何影响线粒体形态和功能的,我们首先对SLC33A1的亚细胞定位进行研究。已有文献报道,SLC33A1是定位于内质网上Ac-CoA的转运体,可参与多种内质网蛋白的乙酰化修饰过程进而影响其生物学功能的维持,如APP切割蛋白BACE1、低密度脂蛋白受体LDLR和自噬相关蛋白ATG9A等。通过免疫荧光共定位分析,我们首次确认SLC33A1不仅定位于内质网,还部分定位于线粒体上。因此,我们推测SLC33A1参与线粒体相关蛋白的乙酰化修饰过程,从而影响了其功能的维持。综上所述,我们确定Slc33a1S113R基因敲入杂合子小鼠脊髓神经元细胞中线粒体形态异常。并且Slc33a1S113R错义突变引起线粒体轴浆运输异常,导致神经元轴突中线粒体堆积,造成轴突的肿胀。此外,线粒体膜电位及ATP合成能力受到影响。通过免疫荧光共定位,确定SLC33A1在细胞内与线粒体存在部分共定位情况。以上研究为进一步认识SLC33A1的功能及探讨Slc33a1S113R错义突变导致HSP的发病机制提供了新的线索。