论文部分内容阅读
第一部分人胎盘胎儿侧来源间充质干细胞（PMSCs）培养及其外泌体提取体系的建立第一节人胎盘胎儿侧间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的 从人胎盘胎儿侧组织提取可以多向分化的间充质干细胞（Placenta mesenchymal stem cells,PMSCs）,进行分离培养和鉴定,建立适合本研究的间充质干细胞培养体系。方法选取正常健康孕妇37-42周足月胎儿的新鲜胎盘组织,采用无血清培养基应用细胞贴壁法分离培养PMSCs。对获得的细胞进行鉴定包括:基本形态观察,流式细胞术检测PMSCs特异性表面标志分子的表达,试剂盒诱导并检测其分化能力。结果1.PMSCs贴壁后以旋涡状、集落生长,呈梭形,形态典型、分布均一,PMSCs表达 CD73（100%）、CD90（99.98%）和 CD105（97.01%）,不表达 CD34（0.00%）、CD45（0.08%）、CD11b（0.00%）和HLA-DR（0.75%）,具有典型间充质干细胞特征。2.在成脂肪细胞诱导培养后,应用油红O染色,发现细胞内有脂肪滴形成,呈明亮红色;经成骨细胞诱导培养后,茜素红染色,观察到细胞间钙结节沉积物形成,呈红色致密、不透光团块,提示PMSCs具有多向分化能力。结论建立无血清培养体系,成功分离培养PMSCs,符合国际干细胞协会定义的间充质干细胞特征,且再传代培养后仍保持良好的细胞活性,为后续提取外泌体提供了实验基础。第二节人胎盘胎儿侧间充质干细胞来源外泌体提取及鉴定目的获取并鉴定人胎盘胎儿侧间充质干细胞外泌体（Placentamesenchymal stem cell exosomes,PMSC-Exos）,为后续急性心肌梗死干预实验奠定基础。方法采用（差速）超速离心法提取外泌体,离心第3代至第6代的PMSCs培养上清液中提取外泌体,随后对外泌体采用系列方法进行鉴定:1.透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）检测 PMSC-Exos 的形态特征;2.纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）对 PMSC-Exos 的粒径、浓度、分布进行测算;3.Western blot分析PMSC-Exos表面标记分子CD9和TSG101的表达;4.转录组测序分析PMSC-Exos中mRNA及非编码RNA的组成。结果通过（差速）超速离心法提取的外泌体PMSC-Exos,经TEM发现到特殊的圆形或椭圆形、大小均一且具有完整脂质膜结构的囊泡;进一步通过NTA分析,显示外泌体大小集中在60-200nm左右,平均大小为130.6nm的外泌体占总数的99%;采用western blot证实PMSC-Exos特异性表达外泌体标志分子CD9和TSG101,表明成功从人类PMSCs中分离出外泌体;经转录组测序及生物信息学分析,表明PMSC-Exos中含有多个mRNA和非编码RNA（miRNA、LncRNA和cirRNA）分子,归纳出了高表达分子并注释了相应的基因功能（GO）和信号通路（KEGG）。结论成功提取并获得高纯度PMSC-Exos并初步说明了其转录组组成,为后续其功能研究奠定基础。第二部分急性心肌梗死修复期免疫炎症因子变化目的构建小鼠心肌梗死模型并进一步分析急性心肌梗死修复期免疫炎症因子的改变,明确免疫炎症在急性心肌梗死中的作用。方法采用8周龄雄性C57BL/6小鼠（体重20-22g）,随机分为2组（15只/组）:急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）模型组和假手术组（Sham组）。其中,AMI组无创通气,钝性分离进入胸腔,在直视环境下结扎心脏冠脉前降支（Left anterior descending coronary artery,LAD）。Sham组手术操作过程与模型组相同,但冠状动脉前降支下仅穿线而不予结扎。在LAD结扎前2min和结扎后5min采用心电图鉴定模型。心肌梗死模型建立后第28天,采用超声多普勒检测室壁厚度、室壁运动及心脏收缩功能;当天处死小鼠后,取出心脏制备冷冻及石蜡切片,经HE染色、Masson三色染色观察心肌细胞纤维化及炎症改变。收集造模后血浆及心肌组织,检测炎症介质包括单核细胞趋化因子-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6、脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）。进一步检测心肌坏死标记物包括天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transaminase,AST）、脑钠肽（Brain natriuretic peptide,BNP）、肌红蛋白（Myoglobin,MYO）和肌钙蛋白I（Troponin-I,Tn-I）。比较AMI组与Sham组之间是否存在炎症因子及其坏死标记物变化;明确血浆脂质指标高密度脂蛋白（HDL）和总胆固醇（TC）水平。结果AMI模型组小鼠2只死于术中,4只死于术后1周。其余两组共计24只留观到术后第28天均存活。成功建立小鼠AMI模型,LAD阻断30秒,肉眼可见结扎处下侧粉红色心肌转为苍白色,局部室壁活动度减弱甚至消失。在结扎冠脉后5min后,AMI组与Sham组相比,发现心电图Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、AVF导联ST-T融合抬高。在AMI造模成功后第28天,心脏超声多普勒结果提示AMI组心肌梗死区室壁运动减弱或部分消失,伴有室壁变薄,左室后壁舒张末厚度（LVPWD）变薄（P=0.0058）,左室射血分数（LVEF）降低（P=0.0003）,左室短轴缩短率（LVFS）显著降低（P=0.0005）,左室舒张末期内径（LVEDD）增大（P=0.0004）,左室收缩末容积（LVEDV）增大（P=0.0003）。处死小鼠,HE染色表明AMI组梗死区与非梗死区界限明显,梗死区心肌细胞排列紊乱,具有坏死的心肌细胞,伴有炎症细胞浸润。Masson染色显示,AMI组仅有少数粉红色正常心肌,可见到显著增加的蓝染胶原纤维。AMI组心肌坏死标记物（AST、BNP、MYO、Tn-I）、血浆及心肌组织炎症分子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、LPS）及脂质指标（HDL和TC）均明显升高（P＜0.05）。这些结果提示心肌梗死模型构建成功,心肌梗死后存在炎症反应及纤维化改变。结论通过无创通气、直视环境下结扎LAD,成功构建了 AMI动物模型,明确了AMI修复期存在炎症反应,为接下来探索人PMSC-Exos干预AMI及其炎症做好了动物模型准备。第三部分人胎盘胎儿侧间充质干细胞外泌体（PMSC-Exos）通过改变炎症和肠道菌群抑制急性心肌梗死后心室重构的作用研究目的探索人胎盘胎儿侧PMSC-Exos干预AMI的效果,揭示其是否通过影响肠道菌群与抑制炎症发挥作用的可能机制。方法首先成功提取PMSC-Exos和构建AMI模型;随后采用PMSC-Exos经小鼠尾静脉在心梗后第7、9、11天注射治疗。干预4周后,采用多普勒超声检测室壁运动、室壁厚度、心室大小及心功能;处死小鼠并分离心脏,制备石蜡切片,经HE染色和Masson染色评价心肌细胞坏死、炎症以及纤维化改变;同时收集各组小鼠新鲜粪便经16S rRNA高通量测序分析PMSC-Exos对于肠道菌群组成的影响,进一步采用气相色谱-质谱（GC-MS）分析肠道菌群代谢产物-短链脂肪酸（SCFAs）的含量;分别收集并检测血浆和心肌组织中脂质代谢指标（高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG））、心肌坏死标记物、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）及脂多糖（LPS）。对比分析上述检测结果在Sham组、AMI模型组、PMSC-Exos干预组之间的变化特征。结果与AMI组相比,PMSC-Exos组左心室舒张末内径缩小（LVEDD,P=0.0031）、左心室舒张末期容积缩小（LVEDV,P=0.0026）、左心室射血分数增加（LVEF,P=0.0228）和左心室短轴缩短率增加（LVFS,P=0.042）,提示PMSC-Exos干预明显改善AMI心功能。与此同时,PMSC-Exos干预能够显著降低心肌坏死相关分子包括血浆BNP（P=0.0149）、Tn-I（P=0.0014）和心肌组织 AST（P=0.0011）、BNP（P=0.0199）、MYO（P=0.0265）、Tn-I（P=0.0184）。进一步分析改善机制,发现 PMSC-Exos 干预后,血浆和心肌组织促炎因子IL-1β（P=0.009）、IL-6（P=0.0181）、TNF-α（P=0.0126）和MCP-1（P=0.0415）显著降低,血浆LPS水平明显降低（P=0.0299）,提示PMSC-Exos能够显著抑制AMI炎症反应。此外,由于血浆LPS来源于肠道菌群,本研究进一步分析了 PMSC-Exos对肠道菌群的影响,结果表明门水平上厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）比值（F/B 比值）在干预后显著降低（P=0.0311）;属水平上艾克曼氏（Akkermansia,P=0.0489）和双歧杆菌（Bifidobacterium,P=0.0179）的相对丰度显著增加;由于SCFAs作为重要的肠道菌群代谢产物,可能参与了对炎症反应的调节。本研究分析其含量发现,异丁酸（P=0.0405）、丁酸（P=0.0018）和戊酸（P=0.0032）的含量显著增加。另外,PMSC-Exos治疗组HDL-C水平有下降趋势,LDL-C、TC和TG无变化,这些指标经统计学分析均无显著差异（P＞0.05）。结论PMSC-Exos通过抗炎和调节肠道菌群及其代谢产物SCFAs改善AMI。第四部分急性冠脉综合征患者肠道菌群和免疫炎症变化目的通过分析急性心肌梗死（AMI）、不稳定性心绞痛患者（UAP）等急性冠脉综合征（ACS）患者与健康人群（HC）在肠道菌群组成及炎症因子是否存在差异,进一步明确炎症及肠道菌群在ACS中的作用。方法收集2019年4月至2019年10月宁夏医科大学总医院心脏中心内科住院患者,行冠脉造影术（CAG）明确急性心肌梗死（AMI）、不稳定性心绞痛（UAP）等急性冠脉综合征（ACS）诊断,收集患者粪便标本和血液标本,分析临床常规指标,采用16S rRNA高通量测序分析粪便肠道菌群组成;采用流式蛋白定量法（CBA）检测血浆炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、MCP-1 及 LPS 水平。结果与HC健康组相比,AMI组体重指数（BMI）、AST、Tn-I、TC、HDL-C、LDL-C、高同型半胱氨酸（HCY）、C反应蛋白（CRP）及促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、LPS）明显升高（P＜0.05）;UAP 组与 HC 对照相比,BMI、TC、HDL-C、LDL-C、CRP 明显升高（P＜0.05）。肠道菌群分析表明,AMI组与HC组存在共同菌789种,AMI组特有368种;UAP组与HC健康组有共有菌788种,UAP特异菌414种;AMI、UAP与HC健康共同菌596种。ACS（AMI、UAP）与健康HC组对比,在门水平上,厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌,厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度、F/B 比值明显降低,而拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）相对丰度显著升高。与HC健康组对比,在属水平上,ACS（AMI、UAP）组升高的菌包括拟杆菌属（Bacteroides）、Parabacteroide、肠杆菌属（UnidentifiedEnterobacteriaceae）、异常小球菌属（Subdoligranulum）、艾克曼氏菌（Akkermansia）、另枝菌（Alistipes）、链球菌属（Streptococcus）、普雷沃菌属（Paraprevotella）;而布劳特氏菌（Blautia）、Agathobacter、厌氧棒杆菌（Anaerostipes）和双歧杆菌（Bifidobacterium）则明显降低。进一步分析,发现上述差异肠道菌与炎症因子存在显著相关性。结论ACS患者存在肠道菌群失调及炎症反应且后两者密切相关。