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内质网是真核生物中非常重要的细胞器,它调控所有的分泌蛋白、大多数膜蛋白的折叠和加工。当未折叠蛋白或错误折叠蛋白在ER的积累超过了细胞折叠机制,这将引起内质网胁迫(ER stress),细胞可以启动未折叠蛋白响应(unfolded protein response,UPR)来缓解胁迫。但是当胁迫较严重或持续时间较长时,机体就会启动程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。BAX Inhibitor 1(BI-1)是植物和动物中非常保守的细胞凋亡抑制因子,可以调节源于ER胁迫的促生存和促死亡信号。GAAPs(Golgi anti-apoptoticprotein)是植物中也存在的BI-1类因子。实验室前期研究发现,拟南芥中的GAAP1在抵御ER胁迫和盐胁迫方面发挥一定的作用,PAS2(PASTICCINO2)是GAAP1 互作因子之一。PAS2 是极长链脂肪酸(Very-long-chain fatty acids,VLCFA)合成中的必需酶,VLCFAs不仅与植物抗性有着密切的联系,而且影响参与PCD信号的鞘酯类的形成。为了进一步研究GAAP1和PAS2在ER胁迫中的功能,阐明高等植物对ER胁迫的抗性机制,本文探究了 ER胁迫下GAAP1及GAAP1和PAS2双突变对UPR及PCD的影响,主要研究结果如下:1、GAAP1在整体与细胞水平正调控ER胁迫抗性。ER胁迫下,GAAP1突变体和35S::eYFP-GAAP1的健壮植株百分率低于Col、死亡率与根长抑制率高于Col,而35S::GAAP1中与之相反。在细胞水平分析地上部分的活性氧和死细胞情况,发现突变体的DAB染色和台盼蓝染色较深,而35S::GAAP1的染色较浅。通过MDC染色自噬体的结果显示,TM处理后gaap1gaap3根部的自噬体数目显著增加。通过DAB、PI和台盼蓝染色发现,根尖过渡区细胞对ER胁迫最敏感,且突变体根部的活性氧、细胞膜透性和死细胞数目高于Col,而35S::GAAP1中低于Col。这些都表明GAAP1在整体与细胞水平正调控ER胁迫抗性,而35S::eYFP-GAAP1对ER胁迫表现为敏感性。2、GAAP1参与持续ER胁迫下的UPR关闭,并减缓PCD通路的启动。持续ER胁迫下,检测UPR通路下游基因发现,35S::GAAP1中IRE1通路响应的保护基因提前削弱,bZIP28通路影响不大;PCD相关基因的表达则被减缓推迟。这与ER胁迫下的抗性结果一致。进一步分析短暂ER胁迫后恢复过程中UPR响应基因的变化,发现35S::GAAP1加快bZIP28和IRE1通路的关闭;可诱导PCD发生的PR-1在35S::GAAP1中的表达量低于Col;IRE1通路分支的RIDD路径中的PR-4在35S::GAAP1中低于Col,说明GAAP1对分泌途径中至少部分基因的mRNA水平有抑制作用。这些结果说明,GAAP1加快bZIP28和IRE1通路的关闭,并负调控PCD的启动。3、GAAP1和PAS2双突变在整体与细胞水平增强ER胁迫敏感性。Gaap1pas2的萌发率低于Col,说明GAAP1和PAS2双突变影响种子的萌发。ER胁迫下,gaap1-1、pas2-5和gaap1pas2的健壮植株百分率低于Col,而死亡率高于Col;gaap1pas2的平均鲜重及含水量都低于Col、净光合速率降低且电导率高于Col。ER胁迫下观察根部发现,gaap1pas2的根长抑制率高于Col。这说明PAS2单突变、GAAP1和PAS2双突变都会增强植株对ER胁迫的敏感性。与此相一致的是,通过DAB和台盼蓝染色发现,gaap1pas2地上部分的活性氧水平和死细胞数目高于Col;通过FDA和PI染色发现,gaap1pas2的根部细胞活力变化率最大、膜透性变化率最高。这些都表明GAAP1和PAS2双突变在整体与细胞水平增强ER胁迫敏感性。4、GAAP1和PAS2双突变延缓UPR关闭并促进PCD。持续ER胁迫下,检测UPR通路下游基因发现,pas2-5和gaap1pas2较强地启动UPR信号通路;其中gaap1pas2中的IRE1通路能够再次被激活,并且能够维持bZIP28通路;单基因突变对bZIP 28通路影响不大。进一步检测细胞质胁迫标志基因可知,pas2-5较早表现出细胞质胁迫;此时细胞代谢活性基因CAB在gaap1pas2中最低,说明其代谢水平抑制严重,可能是其将较多能量用于UPR的结果。检测PCD相关基因,发现gaap1pas2中这些基因表达量的上调高于Col。这些结果说明,在持续ER胁迫下GAAP1和PAS2双突变不仅持续维持UPR保护性反应,也较早启动PCD通路,这与ER胁迫下gaap1pas2非常敏感一致。5、PAS2可能通过与伴侣蛋白BIP的互作参与调控UPR。在蛋白水平检测ER胁迫的标志蛋白BIP的表达量,发现ER胁迫处理后pas2-5可能通过早上调BIP的表达来启动胁迫响应;进一步通过烟草瞬时转化系统和CO-IP检测手段,发现PAS2与BIP在植物体内互作,说明PAS2可能通过与BIP的互作参与调控UPR。6、GAAP1和PAS2双突变可能降低植物中JA水平,并在持续ER胁迫下上调JA和SA通路活性。为了探究GAAP1和PAS2双突变对ER胁迫的调控机制,通过转录组分析发现,gaap1pas2在ER胁迫下主要影响到JA新陈代谢及JA通路基因的表达,且对SA通路基因也有影响。qPCR分析也表明正常生长时,JA合成途径中的LOX2和LOX3基因表达量在gaap1pas2中低于Col,这有可能影响到JA的合成,与此相一致的是JA通路下游基因PDF1.3、PDF1.2A、PR-4和ORA59在gaap1pas2中的表达量也低于Col。而当TM处理2 d时,gaap1pas2中JA通路下游基因的上调幅度高于Col,这说明持续ER胁迫下,JA通路的部分基因会上调表达,gaap1pas2促进JA通路的上调。检测SA通路下游基因发现,持续ER胁迫下gaap1pas2对SA通路基因的激活是有特异性的,特异性激活与PCD相关的PR-1。这些结果说明,GAAP1和PAS2双突变可能降低植物中JA水平,并在持续ER胁迫下上调JA和SA通路活性。综上所述,通过整体表型观察、细胞水平的染色分析,发现GAAP1在整体与细胞水平正调控ER胁迫抗性;转录水平检测发现,GAAP1参与ER胁迫下的UPR关闭,并减缓PCD通路的启动。同样的研究系统发现,GAAP1和PAS2双突变对ER胁迫极其敏感;在ER胁迫下GAAP1和PAS2双突变不仅持续维持UPR保护性反应,也较早启动PCD通路,PAS2可能是通过与BIP的互作参与调控UPR。转录组分析与定量PCR分析结果表明,GAAP1和PAS2双突变可能降低正常条件下植物中JA水平,并在持续ER胁迫下上调JA和SA通路活性,这可能是其过多能量用于抗性导致极其敏感的一方面原因。进一步研究GAAP1、PAS2是否参与调控UPR受体活性,以及GAAP1与PAS2互作如何参与调控ER胁迫下的PCD发生,将有助于阐明GAAP1对ER胁迫调控的作用机制。