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第一部分骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定目的:建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增和鉴定的方法,了解其作为椎间盘组织工程种子细胞的可行性。方法:穿刺兔股骨大转子抽取骨髓4ml,培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性,流式细胞仪分析细胞表面标记物CD44、CD45。细胞经过诱导分化后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色、阿利新蓝染色、碱性磷酸酶染色及钙结节染色。结果:体外成功建立兔骨髓间充质干细胞培养扩增的方法,并成功诱导出成骨、软骨细胞。骨髓MSCs表达CD44,不表达CD45。Ⅱ型胶原免疫组化染色,阿利新蓝染色,ALP染色及钙结节染色阳性。结论:全骨髓法能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特征,该细胞经诱导后能表现类软骨细胞的特性,是一种有效的椎间盘组织工程种子细胞。第二部分针刺抽吸法诱导椎间盘退变动物模型的建立目的:探讨针刺抽吸法建立椎间盘退变动物模型的可行性。方法:新西兰大白兔18只,用21G皮肤穿刺针从椎间隙正前方刺入L3/4、L4/5、L5/6椎间盘的纤维环,深度控制在5mm,拔出针芯,抽吸出部分髓核组织。术前及术后4、8、12周分别对造模后椎间盘及对照椎间盘(L2/3)行MRI及CR检查,并行免疫组化及组织学观察。结果:术后第4周到第12周,造模后的椎间盘MRI的T2W1信号呈现持续减弱趋势;椎间盘高度指数持续下降;免疫组化及组织学检查显示髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较对照间盘进行性减少,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论:针刺抽吸法可诱导兔椎间盘的缓慢退变,为研究椎间盘退行性变的机理及治疗提供有效的载体。第三部分兔骨髓间充质干细胞在退变椎间盘环境中存活及迁移能力的实验研究目的:探讨兔骨髓间充质干细胞在退变椎间盘环境中存活及迁移能力,为进一步研究提供实验基础。方法:新西兰大白兔9只,穿刺法诱导椎间盘退变模型建立2周后每个退变椎间盘移植入BrdU标记的骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物0.04ml,术后2、4、8周将兔处死,取L3/4,L4/5,L5/6的9个椎间盘髓核组织进行BrdU免疫组织化学染色,随机取9个L2/3髓核作为对照组,计数10个高倍视野中BrdU阳性细胞数。结果:BrdU免疫组化染色可见在2、4、8周均有阳性染色细胞,细胞数为157.11±17.45、68.56±16.89、79.78±22.11,4周及8周组间无统计学意义,P>0.05,其余各组间有统计意义,F=74.59,P<0.01。纤维蛋白移植区阳性细胞数量随时间推移逐渐减少后保持一定数量,部分细胞向髓核组织迁移,正常对照组未见阳性细胞。结论:兔骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶TGF-β1移植后能在退变椎间盘环境中存活及迁移,为椎间盘退变的组织工程学研究奠定了实验基础。第四部分骨髓间充质干细胞复合可注射型纤维蛋白凝胶TGF-β1移植治疗兔椎间盘退变的实验研究目的:探讨兔骨髓间充质干细胞移植抑制椎间盘退变的可行性,为后续的临床研究提供实验基础。方法:新西兰大白兔54只,随机分为3组:(1)退变模型组,(2)单纯纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组(,3)骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组,每组18只。退变模型组单纯用针刺法诱导建立退变模型,单纯纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组退变模型诱导两周后分别移植入纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物,分别于术后4、8、12周(移植术后2、6、10周)行CR、MRI及病理检查。结果:椎间盘高度指数(DHI)在退变模型组及单纯支架移植组中下降明显,与时间呈正相关;正常对照组及干细胞移植组下降较缓慢。MRI结果显示退变模型组及支架移植组随时间的推移,退变逐渐加重,干细胞移植组退变不明显。免疫组化及组织学检查显示退变模型组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较对照间盘进行性减少,细胞凋亡率明显增加,单纯支架移植组与退变模型组相似,干细胞移植组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较退变组及单纯支架移植组明显增多,细胞凋亡率下降。结论:干细胞移植能明显抑制椎间盘退变,为进一步的研究奠定了实验基础。