研究背景与目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,且是除肺癌外导致女性死亡的第二大癌症。相关调查显示,在美国,2018年新诊断出约266120例浸润性乳腺癌,同年因乳腺癌死亡的女性患者约40290位。雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌约占所有不同亚型的乳腺癌的60-70%,有效的内分泌治疗能够改善ER阳性的患者的预后,然而在接受内分泌治疗的患者出现内分泌耐药是不可避免的。因此,寻找新的治疗方法对于提高ER阳性的患者的预后至关重要。乳腺癌的发生发展与细胞周期的调控密切相关,相关研究表明超过50%的乳腺癌标本中存在细胞周期素D(cyclin D)的过表达。cyclin D作为细胞周期关键调控因子,可以激活并结合细胞周期依赖性激酶4和6(CDK4/6),继而使视网膜母细胞基因(retinoblastoma tumor suppressor protein,Rb)及其家族其他成员p107、p103等发生磷酸化,从而释放下游相关的转录因子E2F,促进相关基因的转录,诱导细胞周期发生从G1期至S期的转换。因此,该信号轴可作为乳腺癌治疗的有效靶点。同时,大量的临床研究发现选择性CDK4/6抑制剂在晚期乳腺癌,尤其是ER驱动的乳腺肿瘤显示出有效的作用。但是,该类小分子抑制剂的耐药性已成为临床不可避免的问题。因此,探究其可能的耐药机制及可能的调节靶点,已成为临床ER阳性乳腺肿瘤治疗中亟待解决的关键性问题。本研究旨通过ER阳性的乳腺癌细胞系建立CDK4/6抑制剂耐药株,利用体内体外模型,探讨CDK4/6抑制剂可能的耐药机制,同时也为临床上逆转ER阳性乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药提供新的治疗策略。研究方法:1.建立人乳腺癌耐CDK4/6抑制剂帕博西尼细胞株(MCF-7pR),通过CCK8、蛋白免疫印迹、流式细胞术检测细胞周期及克隆形成等实验验证其耐药性,探究其较亲代细胞生物学特性的改变;2.利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹、免疫荧光等实验方法探究其激素受体(雌激素受体、孕激素受体及雄激素受体)的表达及定位的改变;3.结合文献报道及课题组前期研究成果,利用雄激素受体的激动剂DHT和或敲除雄激素受体,通过CCK8、蛋白免疫印迹、免疫共沉淀、流式细胞术检测细胞周期等实验方法在细胞水平探究帕博西尼耐药可能涉及的信号通路的改变,探究其可能机制;4.构建雄激素受体敲除细胞株,利用CCK8、流式细胞术、克隆形成实验以及免疫印迹等实验探究雄激素受体对帕博西尼耐药细胞株的帕博西尼敏感性及细胞周期转换、细胞增殖等方面的影响;5.利用流式细胞术、蛋白免疫印迹检测雄激素受体恩杂鲁胺和帕博西尼单药或联合使用对细胞周期的影响,利用CCK8和克隆形成实验在耐药细胞株中检测雄激素受体抑制剂恩杂鲁胺和帕博西尼单药或联合的抗增殖能力,同时利用CompuSyn软件计算两药联合的联合指数;6.利用耐药细胞MCF-7pR构建裸鼠皮下移植瘤模型,待瘤体增长至100±50mm~3后将实验裸鼠随机分为空白对照组、帕博西尼治疗组、恩杂鲁胺治疗组以及上述两药联合治疗组,记录并绘制各组肿瘤体积及裸鼠重量变化曲线,治疗结束后取肿瘤组织,并通过免疫组化检测AR及Ki67的表达差异,评估雄激素受体恩杂鲁胺逆转帕博西尼耐药以及两药连用的治疗疗效。结果:1.CDK4/6抑制剂帕博西尼能够显著地抑制ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力,细胞克隆形成能力,抑制其G1期至S期的转换;然而对帕博西尼耐药的细胞株MCF-7pR的细胞增殖能力、克隆形成实验能力及细胞周期的转换无明显的抑制作用。此外,相较于亲代株MCF-7,多药耐药蛋白1在耐药株MCF-7pR中表达量增高,提示帕博西尼耐药株的建立成功;2.与亲代株MCF-7相比,耐药株MCF-7pR出现ER信号的丢失和雄激素受体表达的增加。此外,长期暴露于帕博西尼后,雄激素受体在MCF-7pR细胞核中的定位更为明确;3.在亲代株MCF-7中,激活的雄激素受体可以抑制细胞周期G1期至S期的转换,抑制细胞增殖。而在耐药株细胞MCF-7pR中,激活的雄激素受体的作用与之相反。在亲代株中,激活的雄激素受体能够抑制细胞周期素D1的表达,而诱导其在耐药细胞的表达。激活的雄激素受体可以通过上调细胞周期相关蛋白CCNE1及CDK2的表达,进而促进G1-S期相关细胞周期的进展;同时,CCNE1和CDK2的高表达是和CDK4/6抑制剂的耐药呈正相关。4.在耐药株MCF-7pR中,雄激素受体的干扰能够增强耐药细胞对帕博西尼的敏感性,抑制细胞增殖和细胞周期G1期至S期的转换。5.在耐药株MCF-7pR中,雄激素受体抑制剂恩杂鲁胺能够逆转帕博西尼的耐药性,抑制细胞周期的转换及细胞增殖,且两药连用的联合指数多小于1,协同作用显著。6.在体内实验中,对比恩杂鲁胺和帕博西尼的单药治疗,两者联用显著的抑制了裸鼠移植瘤生长,并且两者联用的毒性在可耐受范围内,对裸鼠的体重无明显影响。同时相较于其他处理组,两药联合应用后,增殖指标ki67的阳性率明显降低。结论与意义:本实验通过低浓度梯度诱导方法成功构建帕博西尼耐药株,证明了雄激素受体在ER阳性乳腺癌帕博西尼耐药表型的形成中发挥重要作用。异常激活的雄激素受体可调节相关G1/S周期相关蛋白的表达,介导细胞周期G1期至S期的转换,该功能轴的异常调控可促进激素受体阳性乳腺癌的耐药形成,抑制其表达能够在一定程度上逆转耐药,抑制增殖,诱导G1/S期的阻滞,为临床ER的乳腺癌患者个体化治疗和逆转CDK4/6抑制剂耐药提供了新的依据和思路。