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研究背景高迁移率族蛋白B1(high mobility protein group B1, HMGB1)是一种高度保守的细胞核蛋白,主要位于细胞核内,是一种非组蛋白染色质结合蛋白,参与基因的复制、重组、转录与修复。最近的研究提示,转录后修饰的1MGB1蛋白可以移出细胞核核进入细胞浆,并进而分泌到细胞外,最终在炎症和肿瘤中发挥重要作用。目前研究已经证实的HMGB1转录后修饰有：糖基化,乙酰化,甲基化,氧化和磷酸化。而且,不同组织来源的细胞执行HMGB1细胞浆定位的蛋白质转录后修饰不同。但是,目前关于HMGB1蛋白在肾透明细胞癌中表达情况,胞浆定位及相关调控机制的研究国内外未见报道。研究方法课题第一部分利用临床收集的14例肾透明细胞癌组织标本和相应的14例癌旁组织标本,采用反转录聚合酶链反应检测上述组织中HMGB1转录水平的差异；采用蛋白质免疫印迹技术检测HMGB1蛋白质表达水平差异；112例肾透明细胞癌组织中HMGB1的表达情况采用免疫组织化学检测。课题第二部分对20例手术切除的肾透明细胞癌组织标本及癌旁组织进行亚细胞结构分步蛋白提取,并对分步提取的蛋白进行蛋白质免疫印迹检测,检测不同组分HMGB1蛋白表达的差异；并对相应临床标本进行免疫组织化学分析,进一步观察HMGB1蛋白的定位。免疫共沉淀技术富集肾癌临床标本中的HMGB1蛋白,行SDS-PAGE电泳,切胶回收蛋白,并胶内酶解为肽段,利用高效液相色谱仪和质谱仪检测HMGB1肽段,采用多种蛋白质序列比对软件(Mascot, Sequest, MODa, MSight)进行质谱数据分析,并利用生物信息学工具(Chimera)模拟HMGB1蛋白的三维结构及修饰后变化。结果第一部分中,10例(10/14,71.4%)肾透明细胞癌中HMGB1mRNA表达水平显著高于癌旁组织；9例(9/14,64.3%)肾透明细胞癌中HMGB1蛋白表达水平显著高于癌旁组织。免疫组织化学显示59.8%(67/112)肾透明细胞癌组织中HMGB1表达显著升高,并且与肿瘤的大小和分级有关(P<0.05)。第二部分中,利用不同方法提取组织细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞膜及细胞器蛋白,证实肾透明细胞癌细胞的胞浆中HMGB1蛋白高表达(12/20,60%,P<0.05)。相应组织的免疫组化染色进一步证实了肾癌中HMGB1蛋白在细胞浆的定位,并且随着Fuhrman核分级的升高,HMGB1蛋白倾向于在细胞浆聚集。对免疫共沉淀富集的HMGB1蛋白HPLC-MS数据分析,发现肾透明细胞癌中HMGB1蛋白的第112位赖氨酸发生了单甲基化。对质谱数据的生物信息学研究证实,K112甲基化位于HMGB1蛋白的DNA结合区,单甲基化可能会影响HMGB1与DNA的结合。结论HMGB1蛋白在肾透明细胞癌中转录与翻译水平均呈高表达状态,并且肾透明细胞癌组织中HMGB1蛋白的表达升高与肿瘤的大小和分级呈正相关。亚细胞结构分布提取、蛋白免疫印迹及进一步的免疫组化研究均证实肾透明细胞癌的细胞浆中HMGB1高表达,免疫共沉淀和质谱技术分析了高表达HMBG1的表观遗传学因素,发现肾透明细胞癌中的HMGB1蛋白第112位赖氨酸存在单甲基化,提示甲基化修饰可能调节了肾透明细胞癌中HMGB1蛋白的核浆转运。