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Apolipophorin-Ⅲ（ApoLp-Ⅲ）是存在于昆虫血淋巴中的一种转运脂肪的营养储藏类蛋白,其属于载脂蛋白家族,在脂肪体中合成,主要用于脂质的储藏和转运,在免疫反应、炎症的发生及抵抗外部细菌的侵染等方面也起着重要的作用。乙酰化修饰是一种重要的可逆蛋白翻译后修饰,可以调控蛋白与DNA的互作、基因转录、应激反应、新陈代谢和蛋白稳定性等,与糖尿病、癌症和心血管病等多种重大疾病有关联。我们前期研究发现,家蚕血淋巴中包括ApoLp-Ⅲ（BmApoLp-Ⅲ）的多种营养储藏类蛋白存在大量乙酰化修饰位点,其中乙酰化修饰可以调控其中的SP2和30K-3蛋白的稳定性。基于前期研究,本课题同样开展乙酰化修饰调控家蚕Bm ApoLp-Ⅲ稳定性的功能研究,为进一步深入研究乙酰化调控家蚕营养储藏和利用的机制打下基础。首先利用RT-PCR的方法从家蚕卵巢细胞总RNA中获得了BmApoLp-Ⅲ基因的编码区片段（ORF）,将其克隆至改造后的真核表达载体pIEX-1-si-GFP中,获得了重组真核表达载体pIEX-1-si-GFP-ApoLp-Ⅲ。转染家蚕BmN细胞,成功表达出HIS融合的BmApoLp-Ⅲ重组蛋白。利用HIS单抗免疫共沉淀获得纯化的BmApoLp-Ⅲ蛋白,乙酰化单抗进行Western blotting检测,结果表明BmApoLp-Ⅲ存在高度的乙酰化修饰,和前期质谱鉴定结果一致。其次,我们采用去乙酰化酶抑制剂LBH589和乙酰化酶抑制剂C646分别上调和下调蛋白的乙酰化水平,结果显示,LBH589和C646处理后,BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达量分别呈现为上调和下调的趋势,并且在转录水平上并无影响,这一结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平影响BmApoLp-Ⅲ蛋白的表达和细胞含量。利用CHX和MG132处理细胞,研究乙酰化修饰对蛋白的降解和积累的影响,结果表明,CHX阻断蛋白合成途径后,与对照组相比,乙酰化水平上调可以明显减缓BmApoLp-Ⅲ蛋白的降解,反之,MG132阻断蛋白降解途径后,乙酰化水平的上调可进一步提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的细胞含量,上述结果表明乙酰化水平的上调可以提高BmApoLp-Ⅲ的稳定性。最后开展BmApoLp-Ⅲ蛋白乙酰化与泛素化竞争实验,结果表明,当BmApoLp-Ⅲ乙酰化水平提高后,其泛素化水平降低,反之亦然,乙酰化和泛素化水平呈负相关结果,推测BmApoLp-Ⅲ的乙酰化与泛素化存在竞争关系。综合上述结果表明,乙酰化修饰可以在翻译后水平上调BmApoLp-Ⅲ的蛋白表达和稳定性,其分子机制可能是通过竞争其泛素化修饰,阻滞泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高蛋白的稳定性和细胞含量。上述结果有望发现家蚕中一种新的调控载脂蛋白稳定性和水解的新机制。另外,我们利用H2O2诱导BmN细胞凋亡,证实BmApoLp-Ⅲ蛋白具有剂量依赖的抗细胞调亡能力,同时LBH589处理细胞后可以进一步显著提高细胞的成活率,而C646却使细胞的成活率显著下降,表明乙酰化修饰可以提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞调亡能力。综合前面的研究结果,推测其机制可能是乙酰化水平的上调提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的稳定性和细胞内该蛋白的含量,从而提高了BmApoLp-Ⅲ蛋白的抗细胞凋亡能力。