中医藏象理论是中医学理论体系的核心组成部分,天人相应是中医认识人体的重要特征之一。在“天人相应”理论直接指导下,所形成的对人体脏腑生理的认识,不同于近代西方医学还原论思想指导下的生物医学模式。它突出了人体的整体协调控制,形成了五脏应时模式。从时间结构的角度认识人体是中医与现代医学从空间结构认识人体的最主要区别所在,是中医基本理论概念如藏象、经络的本质特征所在。因此,从天人相应的角度出发,“以脏应时”已经成为藏象本质研究的重要途径。1.目的从天人理论出发,以“褪黑素”为切入点,通过探讨肾藏象调控理论与褪黑素季节性变化内在调节机制的相关性,从时间结构角度,部分揭示中医肾藏象本质内涵;同时引入四季模拟系统,人工模拟自然季节变化,为中医藏象学说和“天人相应”理论的研究提供新的途径,为中医基础理论的现代研究提供新的思路和方法。2.方法2.1理论研究:采用文献学、逻辑分析等方法,对采用人工模拟系统进行“天人相应”理论研究的必要性、重要性进行了探讨。并结合现代医学神经内分泌免疫网络(NEI)的先进研究成果,对以“褪黑素”为切入点进行藏象本质研究的思路进行了可行性和可信性分析,提出了从褪黑素季节性变化的内在调节机制进行中医藏象时间结构本质研究的方法和途径。2.2实验研究2.2.1研究思路:以褪黑素为切入点,观察在生理状态下,大鼠血清褪黑素(MT)、松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性、AANAT蛋白质水平及mRNA表达的冬夏变化规律,并分析其相关性。另外,结合四季模拟系统进行反季节模拟,对上述指标进行观察,与自然季节下的状态进行比较。2.2.2实验对象:健康SD大鼠,雄性,180-200g/只。在冬至日、夏至日前一个月购入大鼠,按随机数字表法,随机分为自然季节组和模拟季节组。自然季节组:大鼠饲养于采光充足、室温可控的动物房,自然光照(不加人工照明);室温:冬季(17±2)℃,夏季(25±2)℃。湿度自然。模拟季节组:采用四季模拟系统箱。四季模拟箱中的模拟季节与时令季节相反(冬季时模拟夏季;夏季时模拟冬季)。模拟的季节气候因素主要包括光照、温度、湿度。其中主要以昼夜长短的变化作为季节变化的重要参变量。以上动物均可自由摄取水及饲料。饲料为普通鼠全价颗粒饲料。饲养至冬至日(12.22)和夏至日(6.21)晚9时断头处死。2.2.3指标测定血清褪黑素,I125标记放射免疫法;松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性,同位素标记的酶活性测定法;限速酶AANAT蛋白质水平测定,western blot法;限速酶AANAT mRNA表达,荧光实时定量PCR(Real-time PCR)法。2.2.4统计分析方法:所有数据以x±SE表示,组间差异利用SPSS13.0统计软件包进行ANOVA检验,以P<0.05差异为有显著性。变量关系采用直线相关分析。3.结果3.1在自然条件下,冬夏季节大鼠血清褪黑素含量、褪黑素合成限速酶AANAT活性、蛋白质水平、mRNA表达均呈现出冬高夏低的分布趋势,变化非常明显,差异有显著性,p<0.05。褪黑素合成限速酶HIOMT活性有冬高夏低趋势,但其差异无统计学意义(P>0.05)。3.2在四季模拟系统条件下,模拟冬季组褪黑素含量、AANAT酶活性高于模拟夏季组,且有显著性差异(p<0.05),与自然条件下冬夏节律一致;模拟冬季组与自然冬季组相比,模拟夏季组与自然夏季组相比均无显著性差异(P>0.05),提示应用四季模拟系统模拟自然季节较为成功,利用其模拟季节进行科学研究的思路具有可行性。3.3通过SPSS13.0统计软件相关分析发现,正常组大鼠血清褪黑素与松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT活性、蛋白质水平和mRNA表达均呈正相关,相关系数分别为0.950,0.722和0.659,(p<0.01);模拟系统下上述指标依然为正相关,相关系数为0.785,0.713,0.740,(p<0.01)。4.结论4.1基于“天人相应”理论的肾藏象调控机制与褪黑素及其合成限速酶AANAT的季节性变化关系密切,褪黑素可能是肾藏象调控机制的控制器。本次实验通过对血清褪黑素、褪黑素合成限速酶AANAT的酶活性、蛋白质水平及mRNA的表达的冬夏变化规律研究发现,上述各项指标在冬季时功能加强,且均为正相关。结合中医学“五脏应时”理论及前期研究成果可以推断:机体在受到相应环境信息(如光照等)的刺激后,首先激活了松果腺细胞内褪黑素合成限速酶AANAT的功能,主要表现在酶活性的改变,从而使合成的褪黑素呈现季节性变化,松果腺通过MT分泌的改变将环境光照周期的信号传给下丘脑-神经内分泌免疫网络-体内有关的组织和器官,使得它们的功能活动适应外界的变化,从而形成了一系列与季节相应的有规律的综合生理效应。这些生理效应符合中医“肾者,主蛰,封藏之本,精之处也……通于冬气”的论述。4.2从天人相应理论出发,从时间结构角度探讨藏象本质,是认识机体复杂整体调节状态的一个很好途径。通过本次研究结合前期研究成果得出:季节对机体的影响不是单一点的作用,而是涉及到了体内信息调节机制的各个层次,中医肾藏象的时间结构本质具有分子生物学基础。在一定程度上表明了从天人相应理论出发,从时间结构角度探讨藏象本质,是认识机体复杂整体调节状态的一个很好途径。4.3四季模拟系统可以较为成功的模拟自然界气候的大致变化,借助该系统进行“天人相应”理论的相关研究具有可行性及可信性。通过实验证明,在四季模拟系统条件下,血清褪黑素、褪黑素合成限速酶AANAT的酶活性、蛋白质水平及mRNA的表达的冬夏节律与自然条件下一致,与相对应的自然季节组相比均无显著性差异(P>0.05),表明,该气候模拟箱可以组合光照、温度、湿度、风、雨等气象因子来模拟气候的变化,达到人工模拟季节变化的目的。利用其模拟季节进行科学研究的思路具有可行性。通过检索,本项通过四季模拟系统进行“天人相应”肾藏象本质的实验研究,在中医基础理论实验方面具有领先意义,在国内外处于先进水平。