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microRNAs(miRNAs)是真核生物中基因表达的重要调控因子。研究表明，超过60%的人类蛋白质编码基因受到miRNAs调节，与肥胖、癌症、糖尿病等众多疾病息息相关。近年来，研究人员发现植物来源的miRNAs可以通过饮食被哺乳动物吸收并调节一系列基因的表达。尽管已经报道了人体中存在大豆源miRNAs，但对其生物学功能的认识仍然不足。大豆作为常见的营养膳食之一，研究表明长期饮食能够有效降低结肠癌的发病率，因而我们猜测大豆miRNAs可能是大豆预防结肠癌发生中的重要活性成分。本研究利用结肠癌细胞Caco-2和AOM(Azoxymethane)/DSS(Dextran sodium sulfate)诱导的结肠癌小鼠，探讨了大豆miRNAs在预防结肠癌发生中的可能作用及其分子机制。主要实验结果如下：
首先，利用MTT增殖实验、集落形成实验、细胞凋亡实验以及Westernblot实验等方法研究了大豆sRNAs(从大豆中分离纯化的小分子RNA，富含大豆miRNAs)对结肠癌细胞Caco-2生长的影响，并采用生物信息学技术分析了具有潜在抗肿瘤活性的大豆miRNAs。研究发现，大豆sRNAs能够显著抑制人结肠癌细胞Caco-2的增殖活性及集落形成能力，同时降低了促增殖蛋白Ki67的表达。另外，大豆sRNAs通过调控凋亡相关蛋白cleavedCaspase-3、Bax/Bcl-2的表达，进一步促进了Caco-2细胞的凋亡，证明大豆sRNAs能够有效抑制结肠癌细胞的生长。然而，我们发现大豆sRNAs对人正常结肠上皮细胞NCM460的生长无显著影响，表明大豆sRNAs的抗肿瘤活性可能是由于大豆miRNAs的特异靶向性；我们从大豆中共检测到297种已知的大豆miRNAs，分属于120个已知大豆miRNAs家族，其中含量排在前15位的miRNAs家族占大豆miRNAs的99.9%，水平最高的大豆miRNA为gma-miR159a；利用DianaScanmicroT软件预测得到了8种大豆miRNAs(Reads>1000)的2002个可能的人类靶基因(miTG得分≥0.90)，KEGG通路分析发现8个靶基因与结肠癌发生密切相关，相关的5个大豆miRNAs(gma-miR159a、gma-miR156k、gma-miR156b、gma-miR1508c及gma-miR1508a)可能具有潜在的抗肿瘤活性。
其次，利用MTT增殖实验、集落形成实验、细胞凋亡实验、双荧光素酶报告基因及Westernblot实验研究了gma-miR159a(大豆miRNA)对Caco-2细胞生长的作用及其分子机制。研究发现，12.5nM、25nM、50nM的gma-miR159a在不同时间下显著抑制了Caco-2细胞的增殖活性，然而对NCM460细胞无显著影响。50nM的gma-miR159a处理下，Caco-2细胞集落形成率仅为31.5±5.9%。另外，gma-miR159a能够显著促进Caco-2细胞的凋亡，这些结果证明大豆miRNAs能够有效抑制结肠癌细胞的生长；另一方面，TCF7基因是gma-miR159a的有效靶基因之一，gma-miR159a及大豆sRNAs能够显著下调Caco-2细胞中TCF7及c-Myc蛋白的表达水平，然而anti-miR159a(miR159a抑制剂)抵消了gma-miR159a及大豆sRNAs的抑制作用。另外，与Caco-2细胞相比，NCM460细胞中几乎检测不到TCF7蛋白的表达，表明gma-miR159a能够通过特异性靶向TCF7基因介导对结肠癌细胞Caco-2的生长抑制。
最后，通过构建AOM/DSS结肠癌小鼠模型，利用HE染色、免疫组化、酶联免疫吸附(ELISA)及Westernblot实验验证了gma-miR159a对结肠癌的预防作用及其分子机制。研究发现，经过gma-miR159a及大豆RNA(大豆中的总RNA，包含大豆sRNAs)灌胃处理13周的结肠癌小鼠的体重、脾脏重量及结肠长度、肿瘤数量得到显著改善。并且，gma-miR159a及大豆RNA能够修复结肠癌小鼠结肠黏膜的损伤，防止腺瘤的出现；另外，经两种药物干预后，结肠癌小鼠中的炎症水平得到显著改善，其中CD11b蛋白表达水平及炎症因子IL-1β、TNF-α的含量显著下降；gma-miR159a及大豆RNA下调了结肠癌小鼠结肠组织中促增殖蛋白PCNA及Ki67的表达，上调了促凋亡蛋白cleavedCaspase-3的表达，表明其能够抑制结肠癌细胞在小鼠体内的生长；另一方面，我们发现相比于癌旁组织，TCF7及c-Myc蛋白在肠癌组织中被异常激活，然而gma-miR159a及大豆RNA能够显著下调TCF7及c-Myc蛋白的表达，同时anti-miR159a抵消了大豆RNA的抑制作用，表明gma-miR159a通过下调Wnt/β-catenin信号通路中TCF7及c-Myc蛋白的表达介导了结肠癌的发生与发展。
综上所述，本研究证明了gma-miR159a能够通过靶向TCF7基因介导结肠癌细胞的生长。另外，通过长期的饲喂，gma-miR159a能够有效预防小鼠体内结肠癌的发生，揭示了大豆来源的miRNAs在疾病预防及治疗中的重要作用。
首先，利用MTT增殖实验、集落形成实验、细胞凋亡实验以及Westernblot实验等方法研究了大豆sRNAs(从大豆中分离纯化的小分子RNA，富含大豆miRNAs)对结肠癌细胞Caco-2生长的影响，并采用生物信息学技术分析了具有潜在抗肿瘤活性的大豆miRNAs。研究发现，大豆sRNAs能够显著抑制人结肠癌细胞Caco-2的增殖活性及集落形成能力，同时降低了促增殖蛋白Ki67的表达。另外，大豆sRNAs通过调控凋亡相关蛋白cleavedCaspase-3、Bax/Bcl-2的表达，进一步促进了Caco-2细胞的凋亡，证明大豆sRNAs能够有效抑制结肠癌细胞的生长。然而，我们发现大豆sRNAs对人正常结肠上皮细胞NCM460的生长无显著影响，表明大豆sRNAs的抗肿瘤活性可能是由于大豆miRNAs的特异靶向性；我们从大豆中共检测到297种已知的大豆miRNAs，分属于120个已知大豆miRNAs家族，其中含量排在前15位的miRNAs家族占大豆miRNAs的99.9%，水平最高的大豆miRNA为gma-miR159a；利用DianaScanmicroT软件预测得到了8种大豆miRNAs(Reads>1000)的2002个可能的人类靶基因(miTG得分≥0.90)，KEGG通路分析发现8个靶基因与结肠癌发生密切相关，相关的5个大豆miRNAs(gma-miR159a、gma-miR156k、gma-miR156b、gma-miR1508c及gma-miR1508a)可能具有潜在的抗肿瘤活性。
其次，利用MTT增殖实验、集落形成实验、细胞凋亡实验、双荧光素酶报告基因及Westernblot实验研究了gma-miR159a(大豆miRNA)对Caco-2细胞生长的作用及其分子机制。研究发现，12.5nM、25nM、50nM的gma-miR159a在不同时间下显著抑制了Caco-2细胞的增殖活性，然而对NCM460细胞无显著影响。50nM的gma-miR159a处理下，Caco-2细胞集落形成率仅为31.5±5.9%。另外，gma-miR159a能够显著促进Caco-2细胞的凋亡，这些结果证明大豆miRNAs能够有效抑制结肠癌细胞的生长；另一方面，TCF7基因是gma-miR159a的有效靶基因之一，gma-miR159a及大豆sRNAs能够显著下调Caco-2细胞中TCF7及c-Myc蛋白的表达水平，然而anti-miR159a(miR159a抑制剂)抵消了gma-miR159a及大豆sRNAs的抑制作用。另外，与Caco-2细胞相比，NCM460细胞中几乎检测不到TCF7蛋白的表达，表明gma-miR159a能够通过特异性靶向TCF7基因介导对结肠癌细胞Caco-2的生长抑制。
最后，通过构建AOM/DSS结肠癌小鼠模型，利用HE染色、免疫组化、酶联免疫吸附(ELISA)及Westernblot实验验证了gma-miR159a对结肠癌的预防作用及其分子机制。研究发现，经过gma-miR159a及大豆RNA(大豆中的总RNA，包含大豆sRNAs)灌胃处理13周的结肠癌小鼠的体重、脾脏重量及结肠长度、肿瘤数量得到显著改善。并且，gma-miR159a及大豆RNA能够修复结肠癌小鼠结肠黏膜的损伤，防止腺瘤的出现；另外，经两种药物干预后，结肠癌小鼠中的炎症水平得到显著改善，其中CD11b蛋白表达水平及炎症因子IL-1β、TNF-α的含量显著下降；gma-miR159a及大豆RNA下调了结肠癌小鼠结肠组织中促增殖蛋白PCNA及Ki67的表达，上调了促凋亡蛋白cleavedCaspase-3的表达，表明其能够抑制结肠癌细胞在小鼠体内的生长；另一方面，我们发现相比于癌旁组织，TCF7及c-Myc蛋白在肠癌组织中被异常激活，然而gma-miR159a及大豆RNA能够显著下调TCF7及c-Myc蛋白的表达，同时anti-miR159a抵消了大豆RNA的抑制作用，表明gma-miR159a通过下调Wnt/β-catenin信号通路中TCF7及c-Myc蛋白的表达介导了结肠癌的发生与发展。
综上所述，本研究证明了gma-miR159a能够通过靶向TCF7基因介导结肠癌细胞的生长。另外，通过长期的饲喂，gma-miR159a能够有效预防小鼠体内结肠癌的发生，揭示了大豆来源的miRNAs在疾病预防及治疗中的重要作用。