人乳头瘤病毒(HPV)是人类多种疾病的致病原，能够引起包括宫颈上皮在内的多种皮肤粘膜上皮的增殖，如宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、皮肤生殖器疣状增生和喉乳头状瘤病等。皮肤粘膜局部发生的HPV感染还会促进人类免疫缺陷病毒(HIV)的传播，因为局部的炎症会使皮肤产生细小的损伤，并且有淋巴细胞和吞噬细胞浸润，这都有利于HIV进入机体并感染靶细胞。由HPV持续感染引起的宫颈癌是死亡率极高的妇女恶性肿瘤，对患者的生理和心理造成了极大的伤害，严重危害了人类健康。虽然早期发现，早期手术并结合化疗和放疗治疗宫颈癌能有效缓解病情，提高患者的五年生存率，但是却使患者的生活质量大大降低，并且不能最终清除被病毒感染的细胞，防止肿瘤复发。研究证实具有致癌性的人乳头瘤病毒的持续感染是宫颈癌主要病因，95％以上的病例可以由HPV16，18，31，33，45和56型的感染来解释，而HPV16则是癌组织内最常见的一种，检出率超过50％，因此研制一种有效针对HPV16的疫苗成为防治由HPV16持续感染导致的宫颈癌的最佳途径。大量的理论和实验资料表明，由晚期基因编码的L1衣壳结构蛋白的C末端数十个氨基酸残基对病毒的自组装是非必须的，去除该区域后连接上60余个外源氨基酸残基仍能自行组装成病毒样颗粒(VLPs)。自我组装形成的VLPs在形态上与真正的病毒颗粒没有差别，并且空间构象相似，但不包含病毒性癌基因组，因此可诱导产生有利的体液免疫反应却没有潜在的致癌危险性，以此达到预防感染的目的。另一方面，为了有效的清除已经感染病毒的细胞，阻止其无限增殖，刺激机体产生特异性的细胞免疫作用同样重要。作为细胞免疫反应的主要效应细胞，细胞毒T淋巴细胞(CTL)在病毒感染时通过两种机制：细胞裂解和细胞凋亡杀伤被感染的细胞，进而在清除病毒和阻止感染慢性化中起关键作用。研究发现，慢性HPV感染者外周血或局部组织中存在特异性CTL，这些CTL可以识别HPV编码蛋白中一个或多个表位。基因重组或人工合成的HPV蛋白多肽，可在体外刺激CTL，增强其溶解HPV感染的靶细胞。更重要的是，CTL可识别细胞内表达的HPV抗原，并对这些表达抗原的细胞有溶解作用。因此，CTL在清除HPV感染中起重要作用。刺激产生CTL的方法很多，其中最常用的是诱导抗原呈递细胞(APC)表达病毒抗原并与主要组织相容性复合物一同刺激CTLs。大部分HPV相关的肿瘤仅表达E6和E7，因此治疗性疫苗的大部分工作都直接针对E6和E7抗原。但是以往的很多研究都是针对E7或E6的全基因片段进行的，但这必然会造成一些变异或可溶性的抗原多肽与CTL的表面受体结合，阻止CTL与被感染的HPV靶细胞发生反应，或者与表位竞争结合靶细胞表面的MHCⅠ类分子，使CTL不能最大程度地发挥杀伤功能。因此，如何解决这一问题，成为研制更加有效的治疗性疫苗的关键。 本实验对如何产生更加有效的预防和治疗性疫苗进行了探索性的研究。首先在以往研究的基础上，利用L1蛋白在C端缺失数十个氨基酸仍可自行组装这一特性，选取其M1-Q471的基因片段为目的基因一。目的基因的模板来源于HPV16标准病毒株pHPV16，采用分段PCR的方法扩增出L1序列的两部分L1a和L1b，分别以限制性内切酶SalⅠ，BamH和XbaⅠ，BamHⅠ双酶切后逐一插入克隆载体pUC19中，构建出包含L1的克隆质粒pHPV16L1。同时选取能最为有效激活特异性CTL反应的单一表位E749-57的基因片段为目的基因二，并将其连接到片段一的下游区域，构建融合基因。E749-57的氨基酸序列为RAHYNIVTF，通过人工合成相应的编码核苷酸序列，并引入合适的酶切位点和翻译终止信号。将目的基因二与克隆载体pUC19连接后通过蓝白斑筛选和测序鉴定确定阳性重组克隆pUC19E7CTL。再将用SalⅠ和XbaⅠ双酶切获得的L1序列克隆入pUC19E7CTL中，获得包含融合基因的重组质粒pHPV16L1/E7CTL，并通过酶切鉴定和测序确定融合基因的核酸序列与GENEBANK中的标准序列相比准确无误。其次，本实验选用了利用转座原理构建的Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统，这一系统具有操作简便，费用低廉以及表达准确等优点。用SalⅠ和KpnⅠ双酶切后将上一步骤所得的融合基因L1/E7CTL再一次通过亚克隆的方法插入转运质粒pFastBacl中，获得重组pFastBaclHPV16L1/E7CTL。该转运质粒含有转座子Tn7，将目的片段转化感受态的DH10Bac后，能够在DH10Bac内所含的帮助质粒提供的转座酶的作用下，定点转座至线性穿梭质粒Bacmid上miniattTn7位点.转化后的DH10Bac在涂布含庆大霉素、卡那霉素、四环素、Bluo-gal和IPTG的LB平板上培养，通过蓝白斑筛选出包含重组杆粒的阳性克隆，获得重组杆粒BACMIDDNA，并以通用引物M13PCR鉴定插入片段的大小。继而将纯化的重组杆粒与转染因子Cellfectin混匀，在超净台中转染sf9昆虫细胞。72小时后观察细胞形态，部分细胞出现了典型的感染征象，表明获得的重组杆粒能够转染昆虫细胞。为下一步实验进行重组蛋白的表达，研究重组蛋白的免疫活性，生物学活性和空间构象提供了有利条件，为下一步用动物实验研究此重组蛋白的作用打下了工作基础，为研制能够有效预防和治疗HPV16感染的嵌合体病毒样颗粒疫苗积累了理论和实验基础。