研究背景和目的临床研究表明,心肌肥大是高血压、心脏瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心脏病等临床常见疾病的一种并发症,是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应。初期的心肌肥大有一定的代偿意义,但持续性心肌肥大,最终可导致心力衰竭,甚至猝死。因此,积极探明心肌肥大的发生机制,必将有利于减少心血管事件的发生。粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一个多功能非受体型酪氨酸激酶,是细胞内多条信号转导通路的枢纽,其磷酸化可促进心肌肥大的发生发展。粘着斑相关非激酶(FAK related non-kinase,FRNK)是FAK基因剪接产生的不具催化活性的C末端序列,其分子中缺乏FAK的N末端和激酶结构域。FRNK与FAK一样,都具有粘着斑定位序列(focal adhesion targeting sequence,FAT),因此可与FAK竞争结合粘着斑,进而特异性阻断FAK的磷酸化。那么,作为FAK的一种抑制性同源蛋白,FRNK是否可以通过影响参与心肌肥大的信号转导分子,从而减轻甚至逆转心肌细胞肥大呢?它对体内压力超负荷所致病理性心肌肥大的治疗作用又如何呢?带着这些疑问,本文从血管紧张素Ⅱ诱导的体外乳鼠心肌细胞肥大模型和腹主动脉狭窄所致体内心肌肥大大鼠模型两个层面研究了FRNK基因治疗对心肌肥大的影响。方法首先根据NCBI核酸数据库报道的FRNK cDNA序列,设计一对特异性引物,并分别在上下游引物的5′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR技术逆转录得到FRNK cDNA全长序列。利用BamHⅠ/EcoRⅠ酶切位点连接至真核表达载体pcDNA3.1上,构建pcDNA3.1-FRNK重组质粒,并进行限制性酶切分析和测序鉴定。然后原代培养乳鼠心肌细胞,经AngⅡ诱导建立体外心肌肥大模型,并用脂质体介导pcDNA3.1-FRNK重组质粒或pcDNA3.1空质粒转染心肌细胞。测定心肌细胞表面积和蛋白质含量。半定量RT-PCR法检测心肌肥大特征性基因心钠肽(ANP)mRNA的表达。Westernblot法检测心肌细胞FRNK、磷酸化FAK、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)信号分子的蛋白表达。最后将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠制备腹主动脉狭窄模型,随机分成:FRNK组(n=10)、pcDNA3.1组(n=9)及单纯手术组(n=8)。其中FRNK组和pcDNA3.1组在术后1周,按4.0 mg/kg体重剂量经尾静脉分别注射重组质粒(pcDNA3.1-FRNK)或空质粒(pcDNA3.1),3周后按相同剂量重复注射。假手术组(n=9)仅游离腹主动脉但不结扎。术后7周,通过左心导管测定各项血流动力学参数评价心功能;测定大鼠心脏重量/体重和左室重量/体重;心肌组织苦味酸天狼猩红染色评价心肌间质胶原沉积情况;RT-PCR检测心肌肥大特征性基因心钠肽(ANP)mRNA的表达。Western blot分析导入基因后各组大鼠心肌组织中FRNK及磷酸化FAK的蛋白表达。结果成功克隆FRNK功能片段,构建重组质粒pcDNA3.1-FRNK,限制性核酸内切酶酶切初步鉴定正确后,经序列测定进一步证实所得片段序列与NCBI核酸数据库报道完全一致。通过脂质体介导pcDNA3.1-FRNK转染体外培养乳鼠心肌细胞,可明显下调经AngⅡ触发的心肌细胞表面积和ANP mRNA表达水平的增高(P<0.05),心肌细胞转染pcDNA3.1-FRNK后,高表达外源性FRNK基因,并可显著抑制由AngⅡ引起的FAK磷酸化。FRNK干预后的心肌细胞与肥大心肌细胞相比,p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达量下降,而总AKT、ERK1/2蛋白表达无显著性差异。将pcDNA3.1-FRNK经尾静脉导入大鼠心肌肥大模型后,可引起血流动力学参数LVEDP下降,LVPSP及±dp/dt max上升。FRNK组大鼠心脏重量/体重、左心室重量/体重明显下降,心肌细胞结构基本正常,心肌间质胶原沉积不明显,心肌组织ANP mRNA水平亦显著下降。经pcDNA3.1-FRNK干预后的大鼠心肌组织高表达FRNK蛋白,而FAKTyr397磷酸化水平下调。结论本研究证实:①pcDNA3.1-FRNK可抑制体外血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大反应;该抑制作用与FRNK下调FAK磷酸化水平,继而影响下游信号分子ERK1/2、AKT的活化相关;②将携带FRNK基因的真核表达载体经尾静脉导入至腹主动脉狭窄所致的大鼠心肌肥大模型体内,可在心肌组织有效高表达,并显著抑制心肌肥大引起的FAK磷酸化。③FRNK还可显著抑制心肌肥大时,间质和血管周围胶原沉积,并改善心肌肥大大鼠的心功能。这一研究结果为心肌肥大的治疗开创了全新的思路。课题2FRNK对人乳腺癌细胞增殖的影响研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近来研究表明FAK是乳腺癌恶性表型的标志物,其持续激活与肿瘤细胞增殖密切相关。以往实验研究已证实细胞发生异常增殖的重要机制之一是细胞周期调控功能的失常。FAK作为胞浆内重要的信号转导分子,其关键性活化位点——Tyr397发生自身磷酸化后能显著促进细胞周期的行进。一旦FAK活化受抑,则导致细胞周期阻滞,从而影响肿瘤细胞恶性增殖。FRNK是FAK基因单独表达其C末端结构域产生的同源蛋白,它和FAK一样,都具有粘着斑定位序列(focal adhesion targeting sequence,FAT),可与FAK竞争粘着斑结合位点,但FRNK缺乏FAK的激酶活化区,遂不能引起FAK介导的下游信号分子活化,因此是FAK良好的内源性抑制剂。但目前有关FRNK如何干扰细胞周期,抑制乳腺癌细胞增殖的具体机制尚不清楚。基于上述理论基础,本研究以课题1中成功克隆的FRNK基因作为研究对象,观察其对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435细胞周期的影响,探讨FRNK抑制乳腺癌细胞增殖的可能机制。方法经脂质体分别介导携带目的基因FRNK的重组质粒(pcDNA3.1-FRNK)、阳性对照质粒(pcDNA3.1-GFP)和空质粒(pcDNA3.1)转染MDA-MB-435细胞,以正常MDA-MB-435细胞作为空白对照。通过检测转染后细胞FRNK蛋白的表达,并结合转染pcDNA3.1-GFP后细胞表达荧光的多寡来评估转染效率。转染质粒后48 h,利用Westernblot检测各转染组细胞FAK活化关键性位点Tyr397的自身磷酸化水平。采用MTT法分析转染后12 h、24 h、48 h和72 h各时间点细胞增殖情况。流式细胞术分析转染不同质粒对MDA-MB-435细胞周期的影响,并检测各组细胞核内NF-κB p65的表达。结果pcDNA3.1-FRNK质粒可经脂质体介导高效转染MDA-MB-435细胞,促进细胞FRNK的表达,FRNK表达量在转染后48 h达高峰。高表达FRNK的乳腺癌细胞的FAKTyr39’位点磷酸化受到显著抑制。转染pcDNA3.1-FRNK后,MDA-MB-435细胞增殖趋缓,且这种抑制增殖呈一定的时间依赖性;S+G2/M期的细胞比例较正常细胞显著下降(P<0.05=;MDA-MB-435细胞核内NF-KB p65蛋白表达减少。结论FRNK可通过竞争性抑制乳腺癌细胞FAK第397位酪氨酸(Tyr397)的自身磷酸化水平,进而下调乳腺癌细胞核内NF-κBp65亚基的表达,使MDA-MB-435细胞周期受阻滞,从而显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞增殖。这一研究对我们研究新的肿瘤治疗方法及研发新的抗肿瘤药物具有重要指导意义。