论文部分内容阅读
目的肿瘤多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)的产生是阻碍癌症治疗的重要原因。多项研究发现,P-glycoprotein(P-gp)高表达是导致MDR的重要原因。我们课题组的前期研究发现,P-gp除了介导多药耐药外,还在肿瘤细胞的侵袭、增殖等方面也起到了重要作用。初步研究发现P-gp通过非受体的酪氨酸激酶Src激活下游底物Anxa2来促进耐药乳腺癌细胞的侵袭,但是详细的分子机制尚不清楚。我们推测P-gp可能是通过和其他的蛋白分子相互作用来参与肿瘤细胞其他方面的作用。本研究目的就是通过免疫共沉淀结合高通量蛋白质谱分析来研究P-gp的相互作用蛋白质组,并结合生物信息学的方法对得到的蛋白质进行分析。我们首先确定了 P-gp和RACK1之间的相互作用,然后进一步观察RACK1的表达下降对耐药乳腺癌细胞增殖和迁移的影响,并对P-gp/RACK1/Src蛋白复合体介导耐药乳腺癌细胞增殖、迁移和药物敏感性中的分子机制进行了初步探讨。方法1、采用RT-PCR技术检测正常乳腺组织和乳腺癌组织中MDR1和Anxa2的mRNA表达水平。2、构建MDR1-Flag载体,用双酶切和基因测序对载体进行验证,并转染细胞然后用Western blottingting和免疫荧光染色验证MDR1-Flag在细胞中的表达和定位情况。3、采用免疫共沉淀技术获得与P-gp相互作用蛋白质复合物,再通过高通量蛋白质谱分析与数据库比对搜索获得蛋白质的详细信息。采用生物信息学方法对获得的蛋白质进行分子成分、功能、分布以及功能分类和有关的通路分析,使用蛋白质互作软件Osprey绘制P-gp的相互作用蛋白质网络图。4、采用免疫共沉淀技术验证内源性P-gp与目标蛋白之间的相互作用,用免疫荧光染色的方法检测P-gp和RACK1在细胞内的分布和共定位情况。5、采用小干扰RNA降低耐药乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的RACK1的表达,用Western blottingting技术检测RACK1和P-gp的表达水平。6、采用MTT方法检测RACK1表达下降的耐药乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性,同时用流式细胞术结合罗丹明123检测RACK1表达下降后耐药乳腺癌细胞中P-gp的活性变化情况。7、采用伤口愈合和Transwell实验观察RACK1表达下降对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR迁移能力的影响;采用MTT和克隆形成实验观察RACK1表达下降对耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞增殖能力的影响。8、采用Western blottingting检测RACK1表达下调后Anxa2的磷酸化水平的变化。9、采用免疫共沉淀和Western blottingting的方法分析RACK1表达下降对P-gp和Src、Anxa2结合的影响。10、采用Western blottingting方法研究RACK1表达下调对信号通路上ERK1/2分子激活的影响。结果1、成功构建了 MDR1-Flag真核表达载体,并能够在细胞中正常表达。2、通过免疫共沉淀结合蛋白质谱分析,鉴定得到P-gp相互作用蛋白465个;通过与已知蛋白数据库比对和分析获得P-gp相互作用蛋白质组的生物学功能系统分析结果,并且通过软件Osprey得到P-gp相互作用蛋白质网络图。3、免疫共沉淀实验证明内源性的P-gp与RACK1之间存在相互作用,同时免疫荧光实验证明P-gp和RACK1在细胞中存在共定位。4、RACK1的表达降低并不影响P-gp的表达水平,但是导致P-gp的活性降低,同时提高了耐药细胞对于阿霉素的敏感性。5、下调RACK1表达之后,MCF-7/ADR细胞的增殖和迁移能力都受到抑制。6、免疫共沉淀和Western blottingting实验证明降表达RACK1后,P-gp和Src、Anxa2的相互作用明显减弱。7、与对照组相比下调RACK1表达明显抑制了阿霉素诱导的Anxa2和ERK1/2磷酸化水平。结论1、利用免疫共沉淀结合蛋白质谱分析,再通过蛋白组学分析研究初步建立了P-gp相互作用蛋白质网络。2、在乳腺癌耐药细胞中,P-gp和RACK1之间在功能上存在相互作用,在定位上存在共定位现象。RACK1的表达降低并不影响P-gp的表达水平,但是降低了 P-gp的活性,使得耐药细胞对于阿霉素的敏感性增强。这些结果证明RACK1在P-gp维持多药耐药过程中起到了重要作用。3、免疫共沉淀证明P-gp和RACK1、Src、Anxa2可以形成蛋白复合体。下调RACK1的表达抑制了耐药乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,进一步研究发现细胞中Anxa2的磷酸化水平下降而且信号通路上ERK1/2的磷酸化被推迟,说明下调RACK1可能是通过抑制Anxa2的磷酸化水平并通过推迟信号通路上ERK1/2的磷酸化来影响细胞的生物学行为。另外,免疫共沉淀证明在下调RACK1之后P-gp和Src、Anxa2的结合下降,说明RACK1在P-gp和Src、Anxa2之间的相互作用中起到了重要的介导作用。