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几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分,昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。几丁质代谢随昆虫不同生长发育阶段而变化并保持相对的稳定,对昆虫的正常生长发育是至关重要的。同时,穿透体壁是在昆虫病原真菌感染寄主的重要过程之一。几丁质酶基因转入植物或者生防微生物〔如Bt或病毒)中表达,增加抗虫或杀虫效果。为此有必要加强几丁质酶的研究,为利用基因工程技术改良菌株奠定基础并提供目的基因。本文通过PCR方法分别从东亚飞蝗Locusta migratoria manilensi和金龟子绿僵菌蝗变种Metarhizium anisopliae var. acridum菌株CQMa102中克隆了几丁质酶基因,构建了酵母表达载体,通过毕赤酵母对获得的两个几丁质酶基因进行了表达研究,取得了如下进展:①东亚飞蝗中肠几丁质酶(LmChi)基因的克隆通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗中肠几丁质酶(LmChi) cDNA全序列(登录号:EF092841)。获得的cDNA全长1 604 bp,其中开放阅读框1 452 bp,编码483个氨基酸。编码的氨基酸序列与18家族昆虫几丁质酶有较高的相似性。与其他几丁质酶一样,东亚飞蝗几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点、一个碳端丝氨酸富集区和一个几丁质结合域。②LmChi基因的组织定位针对昆虫几丁质酶基因时序性表达的特点,本研究通过半定量RT-PCR法研究LmChi基因的组织表达情况。结果表明,LmChi基因只在东亚飞蝗不同发育阶段的中肠组织中表达,而在东亚飞蝗体壁、前肠和后肠均没有发现LmChi基因的转录。③金龟子绿僵菌蝗变种菌株CQMa102几丁质酶(MaChi)基因的克隆通过RACE和筛选基因组文库等方法,克隆了金龟子绿僵菌蝗变种菌株CQMa102几丁质酶(MaChi)基因的DNA和cDNA序列。部分序列已经登录到NCBI数据库中(GenBank登录号:DQ097518)。MaChi基因DNA全序列1 973 bp,其中有三段内含子。cDNA全序列1 483 bp,蛋白编码区长1 275 bp,5’端非翻译区121 bp,3’端非翻译区80 bp。编码的氨基酸序列与18家族几丁质酶有较高的相似性。同LmChi一样,绿僵菌几丁质酶序列也包含一个信号肽、一个几丁质酶活性位点。但没有几丁质结合域。④LmChi基因和MaChi基因在毕赤酵母中的表达分别将LmChi基因和MaChi基因的成熟肽编码框连接到表达载体pPIC9K的多克隆位点上,构建了pPIC9K-LmChi和pPIC9K-MaChi重组表达质粒。重组质粒经电穿孔法转化入毕赤酵母表达菌株KM71,PCR方法检测重组情况,筛选阳性转化子。转化子在甲醇的诱导下表达,表达产物上清液中成功的检测到了几丁质酶活性。