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背景和目的宫颈癌是女性癌症死亡的主要原因之一。放射治疗在宫颈癌的治疗中发挥着至关重要的作用。但是如何进一步提高放射治疗的有效性一直是宫颈癌治疗方面的难题。目前认为细胞对放疗的抵抗性是导致宫颈癌患者治疗失败的主要原因。因此迫切需要寻找新的靶点来提高宫颈癌细胞的放疗敏感性。研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达与多种肿瘤的放疗敏感性有关。近来研究发现lncRNA生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-specific 5,GAS5)对宫颈癌等多种肿瘤具有抑制作用。有研究表明GAS5的表达可作为宫颈癌的独立的预后指标,且GAS5可通过调节Akt蛋白激酶磷酸化来增加宫颈癌细胞的顺铂耐药性。另有研究表明GAS5可通过促进细胞凋亡和DNA损伤来增加人前列腺癌细胞的放疗敏感性。然而,对于GAS5能否参与调节宫颈癌细胞的放疗敏感性尚未有研究报道。微小RNA(microRNA,miRNA)广泛参与肿瘤的多种病理过程。MiR-106b在肿瘤中发挥致癌作用,调控细胞凋亡、增殖、分化及细胞周期的进程。研究证实,miR-106b在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织,且其参与多种肿瘤放疗敏感性调控。但是,对于miR-106b是否参与调控宫颈癌的放疗敏感性未见报道。在我们的前期研究中发现放疗抵抗组的宫颈癌组织和细胞中GAS5的表达显著低于放疗敏感组,miR-106b表达显著高于放疗敏感组。通过生物信息学软件(DIANA,LncBase prediction v.2)的目标预测分析发现GAS5是miR-106b的分子海绵。我们推测GAS5可能通过靶向miR-106b参与宫颈癌细胞的放疗敏感性。因此本研究目的为:1.通过体内和体外实验研究GAS5/miR-106b在宫颈癌放疗敏感性调控中的作用;2.探讨GAS5/miR-106b在宫颈癌放疗敏感性调控机制中的关系;3.发现新的宫颈癌放疗敏感性调控的分子机制。这些研究可能会帮助建立对宫颈癌放疗敏感性的新的治疗策略。对象与方法1.选取国际妇产科联盟(FIGO)临床分期为IIB期-IV期20例宫颈癌患者,根据评估标准分为放射敏感组(11例)和放射抗性组(9例)。选取人宫颈癌细胞系SiHa和ME180细胞。2.通过qRT-PCR测定两组肿瘤组织中GAS5及miR-106b的表达水平差异。通过对两组宫颈癌细胞系进行辐射处理后检测SiHa细胞及ME180细胞的存活分数,并检测GAS5及miR-106b的表达水平差异。来探究相关分子与宫颈癌放疗敏感性的关系。3.通过将细胞转染来构建宫颈癌细胞系中GAS5的过表达和干扰,转染后通过qRT-PCR测定GAS5的表达,进一步辐射处理后检测细胞存活分数。进一步探讨GAS5的表达对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响。4.利用LncBase prediction Predicted v.2来分析其可能的靶基因。生物信息学软件分析显示GAS5和miR-106b的潜在组合,采用RNA免疫沉淀和RNA pull down实验来验证GAS5与miR-106b之间的相互作用。5.通过对SiHa细胞和ME180细胞进行GAS5的过表达/抑制±miR-106b的过表达/抑制,检测其辐射之后存活分数的变化。进一步探究GAS5是否通过miR-106b调节宫颈癌细胞的放疗敏感性。6.构建GAS5干扰小鼠模型及GAS5过表达小鼠模型,辐射处理后测量肿瘤体积,qRT-PCR测定GAS5及miR-106b的表达水平差异。进一步在体内验证GAS5对宫颈癌对放疗敏感性的影响。结果1.放疗抵抗组的组织中GAS5表达显著低于放疗敏感组(P<0.01),并且miR-106b表达显著增加(P<0.01);细胞辐射处理后可观察到SiHa细胞的存活分数显著高于ME180细胞(P<0.05),且SiHa细胞中GAS5的表达低于ME180细胞(P<0.01),miR-106b表达高于ME180细胞(P<0.05)。说明放疗抵抗组的宫颈癌组织和细胞中GAS5均降低并且miR-106b表达增高。2.PcDNA-GAS5-SiHa细胞中GAS5的表达增加(P<0.01),辐射处理后存活分数降低(P<0.05);siRNA-GAS5-ME180细胞中GAS5的表达降低(P<0.01),辐射处理后存活分数增加(P<0.05)。说明GAS5的过表达增强了宫颈癌细胞对放疗的敏感性。3.生物信息学软件分析显示GAS5和miR-106b的潜在组合,RIP实验结果显示在AGO2抗体沉淀的产物中,GAS5和miR-106b显著升高(P<0.05),提示两者捅死存在;RNA pull down实验显示miR-106b的表达相比loc285194显著升高(P<0.05),提示miR-106b可能通过序列特异性结合的方式与SiHa细胞中的GAS5相互作用。4.PcDNA-GAS5转染后的SiHa细胞辐射处理后存活分数降低(P<0.05),转染miR-106b模拟物后可逆转该结果(P<0.05);siRNA-GAS5转染后的ME180细胞辐射处理后存活分数增高(P<0.01),转染miR-106b抑制剂后可逆转该结果(P<0.01)。说明GAS5通过抑制miR-106b增强宫颈癌细胞的放疗敏感性5.体内实验中,lenti-siRNA-GAS5组小鼠辐射处理后肿瘤体积增加(P<0.01);qRT-PCR结果显示其组织中GAS5表达下调(P<0.01)并且miR-106b上调(P<0.05);lenti-GAS5组小鼠辐射处理后肿瘤体积减少(P<0.01),且其组织中GAS5表达增加(P<0.01)并且miR-106b下调(P<0.01)。说明体内实验中GAS5的过表达可增强宫颈癌的放疗敏感性。结论GAS5可增强宫颈癌细胞的放疗敏感性,其通过调控miR-106b发挥作用。