胡麻异质性ACCase亚基基因的克隆、CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立与功能表达研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:woshi254211
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胡麻(Linum usitatissimum L.)是我国重要的油料和经济作物。胡麻油脂中人体必需脂肪酸α-亚麻酸含量高达50%以上。乙酰辅酶A羧化酶是所有生物体中催化从头合成脂肪酸的关键酶,是脂肪酸合成过程的限速酶。因此,开展胡麻ACCase基因研究对于明确胡麻油脂合成规律具有重要意义。本研究主要以陇亚10号、张亚2号和R2-17 3个含油量不同的胡麻品种为试验材料,分析了胡麻ACCase基因在这3个品种不同发育时期、不同组织中的表达差异,以及胡麻种子中ACCase基因表达量与含油量的相关性;克隆了陇亚10号异质性ACCase 4个亚基基因的c DNA全长序列,通过CRISPR/Cas9系统对陇亚10号ACCase 4个亚基基因进行定点编辑,主要研究结果如下:1.胡麻ACCase亚基基因c DNA的克隆与序列分析。以陇亚10号为材料,克隆了胡麻ACCase 4个亚基基因的c DNA序列,并利用生物信息学方法分析分析其氨基酸序列。结果表明,陇亚10号acc A、acc B、acc C和acc D 4个基因的c DNA片段大小分别为2364、1173、1584和1137 bp。并且4个基因编码的蛋白质脂肪系数都比较高,且不具有信号肽,不属于分泌蛋白。acc A、acc C、acc D的编码蛋白各有一个跨膜结构域,acc B基因没有跨膜结构域。亚细胞定位预测结果显示,acc A基因编码蛋白定位在线粒体和细胞核中,acc B和acc D基因编码蛋白定位在叶绿体,acc C基因的编码蛋白定位在线粒体中。此外,这4个基因编码蛋白质的三级结构主要由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链组成。陇亚10号acc A、acc B、acc C和acc D 4个基因的功能与其他油料作物相似。2.胡麻ACCase基因的表达模式与含油量的关系。以张亚2号、陇亚10号和R2-17 3个胡麻品种为材料,分析了异质性ACCase基因与同质性ACCase基因在3个品种种子中的表达模式,异质性ACCase基因在3个品种不同发育时期、不同组织中的表达差异,以及ACCase基因在胡麻种子中的表达量与含油量的相关性。结果表明acc A、acc B、acc C、acc D 4个基因的表达量都明显高于同质性ACCase基因,并且在种子发育成熟的过程中,种子发育前期acc A、acc B、acc C、acc D 4个基因的表达量高于种子发育后期,而同质性ACCase基因在种子发育的中后期表达量达到高峰。acc A、acc B、acc C和acc D 4个基因在R2-17、陇亚10号和张亚2号3个品种所有时期、不同组织中均有表达,并且在种子中的表达量均明显高于其他组织。张亚2号、陇亚10号和R2-17种子发育前期(10、15、20、25、30 d)的含油量,以及这3个品种中acc A、acc B、acc C和acc D 4个基因在种子发育前期(5、10、15、20、25 d)的相对表达量均存在极显著的差异,并且呈正相关。3.CRISPR/Cas9系统对胡麻异质型ACCase亚基基因的定点编辑。成功建立了胡麻CRISPR/Cas9技术体系,并构建了CPB-CRISPR/Cas9-acc A、CPB-CRISPR/Cas9-acc B、CPB-CRISPR/Cas9-acc C和CPB-CRISPR/Cas9-acc D等4个敲除载体,之后通过冻融法转化农杆菌GV3101,筛选出阳性菌株。通过蘸花法转化陇亚10号,共计收获acc A基因T 0代硕果64个,种子394粒,获得阳性苗21株;acc B基因转化共计收获T 0代硕果65个,种子318粒,阳性苗2株,acc C基因获得T 0代硕果91个,种子599粒,阳性苗11株;acc D基因共计61个硕果,种子367粒,获得阳性苗3株。
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