研究背景与目的原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)作为一种自身免疫性肝病,其组织学特点表现为肝内小胆管进行性损伤,并最终可导致肝纤维化,肝硬化。国外流行病学调查资料显示PBC的流行率在20~240/100万人口,我国PBC的发病状况目前尚缺乏权威性流行病学资料,近20年来随着血清抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody,AMA)及其亚型等自身抗体检测的开展,以及PBC临床病理认识的提高,研究报道和临床诊断PBC的病例呈大幅度上升态势,有学者认为我国PBC的发病率甚至高于国外文献报道,因此,PBC作为我国重要的非病毒性肝病之一,其危害性不容忽视。PBC发病的始动因素及发病机制尚不清楚。国外研究资料显示,环境因素作用与易感机体是导致PBC免疫功能紊乱的重要因素。有人认为某些病原体可能通过分子模拟机制启动PBC的发生,部分感染性因素与PBC发生乃至进展之间的相关性已初露端倪,但现有的研究证据尚不充分的;也有报道称并非病原微生物直接导致了自身免疫的启动,而是易感机体发生了不适当的抗感染免疫反应,激发PBC的发生。本课题通过人体材料研究与实验研究相结合,在体与离体研究相结合,多学科研究相交叉,较系统地从临床病理、感染因素及免疫病理角度,研究PBC的临床病理改变及LPS在其发病中的作用,旨在分析PBC的临床病理及实验室特点,提高对PBC的认识及诊断水平,探讨G-杆菌细胞壁共有成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其受体在PBC肝损伤发生发展中的作用和地位,并分析PBC患者的抗感染免疫反应状态,从感染性因素这一全新的角度阐述PBC的发生、进展及免疫损伤机制,进而为临床上PBC可能的抗感染治疗,以及临床治疗性干预时机的选择,乃至PBC的早期预防提供理论依据和新的思路或策略。方法收集解放军302医院2001～2007年期间经病理确诊的临床资料完整的100例PBC病例,对其一般资料、临床表现、实验室检查及病理学改变等进行了回顾性分析;采用鲎试剂盒及ELISA方法分别检测PBC患者血清中LPS水平,以及炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平;免疫组织化学染色原位检测LPS受体CD14、TLR4、CD68及NF-κB的表达;分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),流式细胞术检测PBMC中CD14阳性单核细胞的频数及LPS对单核细胞TLR4、CD83表达的影响,ELISA检测上清中促炎细胞因子的浓度,分析机体抗感染免疫反应状态;采用体外细胞培养技术及Western blotting技术检测LPS刺激人源性胆管上皮细胞后TLR4表达变化,ELISA方法测定LPS刺激后胆管上皮细胞分泌促炎因子的变化;应用免疫组织化学及双标记免疫组织化学染色进一步明确肝组织原位免疫细胞的变化及引起胆管损伤的免疫细胞类型。结果1.临床、实验室资料与肝穿刺病理学分析发现,本组病例中PBC患者以中年女性多见,占89%;最常见症状是乏力,其次是黄疸、皮肤瘙痒,多数病例血清胆红素升高,且以直接胆红素升高为主,患者血清ALP、γ-GGT升高3~4倍以上,但随着病情进展二者均有所下降。本组患者AMA的阳性率为70%。AMA阳性和阴性患者IgM升高的比例上存在统计学差异(P<0.05)。PBC的组织病理学改变主要位于汇管区及其周围,小叶内病变较轻。早期主要表现为小叶间胆管的损伤及小胆管的增生;单个核细胞聚集性浸润,形成淋巴滤泡样结构,多围绕损伤的胆管和增生的小胆管。晚期表现为汇管区扩大、纤维化、纤维间隔及假小叶形成、肝硬化。2. PBC患者血清LPS及主要促炎细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8水平升高,且随病程进展而增加,并与血生化指标ALP、TB、DB相关;LPS受体TLR4、CD14及下游分子NF-κB在肝组织内的表达也随疾病进展而上调,尤其是胆管上皮中TLR4的表达水平在PBC患者明显上调。3.新鲜分离的PBMC中,PBC患者CD14频数明显高于正常人,二者之间统计学差异非常显著(P<0.01);与正常人比较,LPS刺激后PBC患者CD14阳性细胞表面TLR4、CD83蛋白表达量明显上调,促炎细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌增加,PBC患者单核细胞对LPS刺激具有高反应性。4.采用人源性胆管上皮细胞系体外培养,与对应时间点(2hr、8hr、24hr)LPS作用的正常人胆管上皮细胞比较,PBC患者源性胆管上皮细胞TLR4表达水平均有所升高(P<0.05);8hr、24hr时间点促炎细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8生成明显上调(P<0.01)。PBC患者胆管上皮细胞较正常人胆管上皮细胞对LPS刺激反应性更为敏感。5.免疫组织化学染色结果显示,与正常肝组织相比较,PBC患者肝组织汇管区内CD3+、CD4+、CD8+、CD20+、CD83+及小叶内CD57+免疫细胞数量增多,其中早期组CD3+、CD4+、CD8+细胞比例偏高,损伤的小胆管周围主要为CD8+、CD4+细胞;晚期组各免疫细胞数目均有所减少。结论1.PBC临床特征表现为:起病隐匿,临床表现多样化,最常见症状是乏力,其次是黄疸、皮肤瘙痒等,血清AMA是其较特异性抗体标志物,肝功能血清酶学检查血以ALP、γ-GGT明显升高,转氨酶(ALT、AST)轻~中等度升高为其特点。对于症状不典型及血清检测无特异性的PBC患者,需依据肝穿刺检查确诊PBC,以避免漏、误诊。2.LPS在PBC肝损伤中可能发挥了较重要的作用,推测LPS可能通过其受体直接引起肝内小胆管(直径40-80μm)及肝细胞损伤,并可能通过促炎因子间接诱导胆管上皮损伤及肝脏炎症和纤维化的发生与发展,推测可能为新的PBC病理损伤机制。3.PBC患者外周血中LPS水平明显升高,并与临床病理分期相关,显示LPS水平检测有可能作为PBC诊断及病情进展的参考指标之一,具有潜在的临床应用价值。4.肝组织内多种免疫活性细胞数目、比例及分布上有其特点,结果提示PBC肝内小胆管树损伤是以Th1介导的细胞免疫损伤为主。PBC患者外周血单个核细胞对LPS具有高反应性,推测包括LPS在内的一些刺激因素可能通过激发系列促炎细胞因子的生成,在机体免疫平衡的失调中发挥作用,可能为PBC的发病机制之一。