脑血管病是导致我国居民死亡的首要因素和成年人残疾的第一原因,其中以脑梗死为主。调查显示,脑梗死具有发病率高、致残率高、复发率高、致死率高和溶栓时间窗短等几大特点,80%的脑梗死患者遗留永久性的残疾,30%的甚至生活不能自理,是基础和临床研究的重点和难点。因此,寻找治疗脑梗死有的效药物,促进患者的康复和预后,提高生存质量,是本研究的目的。脑梗死又称缺血性脑卒中,可导致快速、严重的脑组织损伤,但研究资料显示:损伤后脑组织具有自我修复的能力。这种自我修复能力与神经可塑性密切相关。神经可塑性可以在多个尺度上观察到,从微观结构角度来讲指的是轴突、树突的分支、树突棘形态和密度、突触大小和数量、受体密度和某些大脑区域神经元结构和数量等。从宏观结构来看,行为、环境刺激、思想和情绪也可能通过神经可塑性的神经活动改变而变化,这对健康发育、学习、记忆和脑损伤的恢复具有重要意义。如何促进脑梗死后神经可塑性的恢复,为临床治疗提供新思路,是本研究的切入点。正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)又名丁苯酞,为我国自主研发的治疗脑梗死的国家一类新药。研究发现NBP可阻断脑梗死所致脑损伤的多个病理环节,具有较强的脑保护作用。NBP可明显缩小实验动物局部脑梗死的梗死面积,改善脑能量代谢,促进缺血脑区的微循环和血流量,减轻脑水肿,抑制神经细胞凋亡等作用。NBP持续治疗或序贯治疗有改善神经功能损伤的效果,被列入《中国急性缺血性脑卒中的诊疗指南2014》(Ⅱ级推荐,B级证据),但有关NBP对脑卒中后神经可塑性恢复的机制尚不明确。本研究以健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立电烧灼法局灶性大脑中动脉闭塞(Distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型。研究NBP是否促进脑梗死后神经可塑性的恢复并对其机制进行研究。本研究分为四部分,概述如下。第一部分正丁基苯酞对不同时期脑梗死神经功能恢复的影响目的:1.在脑梗死后超急性期给予NBP治疗,通过行为学评分方法,筛选NBP治疗的有效剂量。2.脑梗死后不同时间点给予NBP延迟治疗,通过行为学评分方法,研究NBP对脑梗死亚急性期和恢复期的神经保护作用。方法:健康成年雄性C57BL/6小鼠,体重20-25 g,8-12周龄,清洁级,电烧灼法建立dMCAO模型。实验一:筛选NBP治疗的有效剂量:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:Vehicle组,NBP不同剂量组(10mg/kg/d,20 mg/kg/d,40mg/kg/d)。术后1小时开始给予NBP腹腔注射并连续注射14天,分别于术前1天至3天、术后3至5天、1周、2周和4周对各组小鼠进行Rotarod Test神经功能评分,同时测量体重变化。实验二:研究NBP对脑梗死亚急性期和恢复期的神经保护作用:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组Sham组,Vehicle组和NBP20mg/kg/d剂量组(NBP),分别于术后1小时,术后24小时,术后72小时和术后7天给予干预,连续干预14天。分别于术前1天至3天、术后3至5天、1周、2周、3周、4周、6周和8周甚至更长时间对各组小鼠进行Rotarod Test神经功能评分,同时测量体重变化。结果:1.脑梗死后NBP对神经功能恢复作用呈现抛物线式剂量相关性脑梗死后1小时给予10mg/kg/d、20 mg/kg/d和40mg/kg/d,续注射14天。在脑梗死后不同时间点进行Rotarod Test行为学评估,发现:术后1周、2周和4周,三种剂量的NBP组与Vehicle组相比均明显差异(P<0.05)。术后3-5天,NBP 10mg/kg/d对神经功能恢复无明显促进作用(P>0.05)。与NBP 10mg/kg/d组和NBP 40mg/kg/d相比NBP 20mg/kg/d组在任何时间点的行为学结果均高于其他两组。鉴于NBP20mg/kg/d组明显改善神经功能评分,且行为学结果不受体重变化影响,我们选择20 mg/kg/d NBP进行后续实验。2.脑梗死后不同时间点给予NBP延迟治疗对于神经功能恢复的影响24h-NBP延迟治疗可以改善脑梗死后亚急性期和恢复期神经功能恢复:脑梗死后24小时腹腔注射NBP 20 mg/kg/d,连续治疗14天。与溶剂对照组相比,24h-NBP延迟治疗在术后第3-5天和1周不能改善神经功能恢复(P>0.05),在术后第2周、3周、4周、6周、8周可明显行为学结果,促进神经功能恢复(P<0.05);72h-NBP延迟治疗可以改善脑梗死后恢复期神经功能恢复:脑梗死后72小时腹腔注射NBP 20 mg/kg/d,连续治疗14天。与溶剂对照组相比,72h-NBP延迟治疗在术后4周以内不能改善神经功能恢复(P>0.05)。在术后第4周、6周、8周可明显行为学结果,促进神经功能恢复(P<0.05);7d-NBP延迟治疗可以改善脑梗死后恢复期神经功能恢复:脑梗死后7天腹腔注射NBP 20 mg/kg/d,连续治疗14天。与溶剂对照组相比,7d-NBP延迟治疗在术后第14周行为学结果才开始有统计学差异(P<0.05)。综上所述,脑梗死后超急性期,急性期和亚急性期给予NBP治疗可以不同程度促进神经功能恢复。但脑梗死后越早进行NBP治疗,其神经功能恢复程度越好。第二部分正丁基苯酞对于脑梗死后不同时期脑血流量的影响目的:用激光散斑成像仪监测小鼠脑梗死后不同时期皮层两侧脑血流量的变化。方法:健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为Vehicle组和NBP 20 mg/kg/d剂量组,通过电烧灼法建立dMCAO模型。术后1小时开始给予NBP腹腔注射并连续注射14天,分别于术前、术后即刻、7天、14天和28天对各组小鼠进行激光散斑成像仪监测脑血流量(cerebral blood flow,CBF),观察NBP对于小鼠大脑皮层两侧血流灌注的影响情况。结果:1.正丁基苯酞可改善脑梗死后亚急性期梗死侧皮层脑血流量激光散斑成像仪监测脑梗死侧皮层血流量,发现NBP能改善术后14天梗死侧皮层CBF(Vehicle组vs.NBP组:80.55%±4.36%vs.97.53%±4.46%,P<0.05)。而术后即刻,7天和28天,Vehicle组和NBP组的CBF相比没有差异(P>0.05),且均与基线水平相比明显降低(P<0.05)。说明正丁基苯酞可以改善脑梗死后亚急性期梗死侧皮层脑血流量。2.脑梗死后对侧皮层脑血流量在不同时期的变化术后即刻测量脑血流量,脑梗死后对侧皮层的脑血流量也降低18%左右(P<0.05)。术后7天和28天,梗死对侧脑灌注量与基线水平相比仍然有差异(P<0.05),术后14天对侧皮层脑血流量达最大恢复水平(P>0.05)。说明脑梗死后对侧皮层也受影响,急性期和恢复期脑血流量明显下降,而亚急性期皮层血流量有所恢复,结合梗死侧皮层血流量变化,提示脑梗死后亚急性期是血流恢复的关键时期。3.正丁基苯酞不能改善脑梗死对侧皮层脑血流量脑梗死后对侧皮层血流量在急性期和恢复期脑明显下降,在亚急性期有所恢复,但Vehicle组和NBP组的对侧皮层脑血流量未观察到明显差异(P>0.05)。说明正丁基苯酞不能改善脑梗死后对侧皮层脑血流量。综上所述,NBP可以改善脑梗死后亚急性期梗死侧皮层脑血流量,但不引起对侧皮层血流量变化。第三部分正丁基苯酞对脑梗死后中枢神经树突和树突棘可塑性的影响目的:通过高尔基染色法(Golgi-stain)观察脑梗死后不同时期梗死周围皮层神经树突生长趋势,树突分级以及树突棘密度,分类和形态来验证NBP对于梗死后树突和树突棘可塑性的促进作用。方法:实验一:观察梗死周围皮层神经树突生长趋势和树突的分级分支数量变化:健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为Vehicle组和NBP 20 mg/kg/d剂量组,通过电烧灼法建立dMCAO模型。术后1小时开始给予NBP腹腔。通过高尔基染色法(Golgi-stain)染色后分别观察术后1天、3天、7天、14天和28天梗死周围皮层树突生长趋势和树突的分级分支数量变化。实验二:观察第V层椎体神经元树突棘密度、分类和形态变化:将C57BL/6小鼠随机分为以下两组组:溶剂对照组(Vehicle)和NBP 20 mg/kg/d剂量组(NBP 20mg/kg/d)。通过高尔基染色法(Golgi-stain)法观察术后28天梗死周围皮层第V层椎体神经元树突棘密度,分类和形态变化。结果:1.正丁基苯酞促进脑梗死后急性期,亚急性期和恢复期梗死周围皮层树突向梗死中心生长梗死后的1天和3天,NBP和Vehicle的梗死周围皮层的树突均没有明显的向梗死中心生长的趋势。在梗死后7天,14天和28天,与Vehicle组小鼠相比,梗死周围皮层NBP 20mg/kg/d组的树突有明显的向梗死中心生长的趋势。2.正丁基苯酞促进脑梗死后不同时期不同部位树突分支的增多正丁基苯酞促进脑梗死后超急性期梗死中心和梗死周围皮层树突的恢复小鼠脑梗死后1小时腹腔注射NBP 20mg/kg,于术后24小时进行高尔基染色观察,发现与Vehicle组小鼠相比,NBP在梗死后1天皮层梗死中心的树突分支第一级和第三级结果明显增加(P<0.05),在梗死后1天梗死周围皮层树突分支第三级数目明显增加(P<0.05)。正丁基苯酞促进脑梗死后急性期,亚急性期和恢复期梗死周围皮层树突的恢复小鼠脑梗死后1小时腹腔注射NBP 20mg/kg/d,连续注射14天。于术后3天,7天,14天和28天进行高尔基染色观察,发现NBP在梗死后3天梗死周围皮层的树突分支第一级,第二级和第三级,梗死后7天梗死周围的树突分支第三级,梗死后14天梗死周围皮层的树突分支第一级,第二级和第三级以及梗死后28天梗死周围皮层的树突分支第一级与第三级数目分别与相同天数的Vehicle组小鼠的树突分级分支相比显著增加(P<0.05)。综上所述,NBP可以促进脑梗死后超急性期,急性期,亚急性期和恢复期不同部位树突分支不同程度的增多,提示正丁基苯酞促进脑梗死后树突可塑性恢复。3.正丁基苯酞促进脑梗死后恢复期树突棘可塑性恢复正丁基苯酞对脑梗死后恢复期树突棘分类比例的影响通过高尔基染色法(Golgi-stain)法观察术后28天梗死周围皮层第V层椎体神经元树突棘分类比例变化。发现与Vehicle组小鼠相比,NBP20mg/kg/d组在梗死后28天梗死周围第V层椎体神经元树突棘Stubby type(S-type)、Mushroom type(M-type)、Thin type(T-type)以及Mushroom type与Thin type的和(M+T-type)均无统计学差异(P>0.05)。这说明NBP不促进某一类型的树突棘增多,其分类比例大致相同。正丁基苯酞促进脑梗死后恢复期树突棘密度的增多树突棘密度方面,与Vehicle组小鼠相比,NBP 20mg/kg/d在梗死后28天梗死周围第V层椎体神经元树突棘S-type,M-type,T-type,M+T-type)以及总树突棘(total spine)均明显增多(P<0.05)。正丁基苯酞促进脑梗死后恢复期树突棘形态的改变梗死后28天梗死周围第V层椎体神经元树突棘形态方面,NBP20mg/kg/d组Vehicle组小鼠相比,树突棘长度(length)和树突棘头部宽度(head width)显著增多(P<0.05)。而树突棘颈部宽度(neck width)两组相比没有差异(P>0.05)。NBP促进树突棘长度增长可以使得树突棘的活动范围更广,接收有效信息的范围更大,学习能力能力增强。NBP促进树突棘头部宽度增大说明树突棘在结构和功能上更加稳定。综上所述,正丁基苯酞促进脑梗死后恢复期不同类型的树突棘密度增多和树突棘长度,头部宽度的增长,提示正丁基苯酞促进脑梗死后恢复期树突棘可塑性恢复。第四部分正丁基苯酞促进实验性脑梗死小鼠轴突再生和其机制的研究目的:通过形态学染色法(BDA)和免疫荧光法观察梗死后恢复期NBP对于轴突的促进作用;通过细胞培养检测NBP对于轴突的促进作用和NBP对于GAP43(Growth Associated Protein 43,GAP43)基因的促进作用;通过测定梗死后不同时期皮层组织内GAP43和磷酸化GAP43(P-GAP43)蛋白水平变化,探究NBP促进轴突可塑性的机制。方法:健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电烧灼法建立dMCAO模型。实验一:应用形态学染色法(BDA)观察脑梗死后神经轴突再生情况:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham),溶剂对照组(Vehicle),NBP 20 mg/kg/d剂量组(NBP 20mg/kg/d)。在脑梗死模型建立后第14天进行BDA对侧大脑皮层注射,并于术后第4周取材进行脑组织免疫组化切片染色和免疫荧光切片染色,观察脑梗死神经轴突再生情况。实验二:应用免疫荧光共聚焦技术观察NBP对于脑梗死周围皮层神经轴突的影响:将C57BL/6小鼠随机分为以下两组组:Vehicle组和NBP 20 mg/kg/d组。通过免疫荧光共聚焦技术(Confocol Technique)观察术后14天和28天,NBP对于梗死周围皮层轴突的影响。实验三:应用细胞培养检测NBP对于轴突的促进作用:取孕15-18天的C57BL/6小鼠的原代培养的皮层神经元进行实验,分为对照组,0.1%DMSO组和不同浓度的NBP(0.1μM,1μM,10Μm,100μM)组,药物作用于神经元细胞24小时后进行后续实验。β-Tubulin免疫荧光细胞化学染色法测定NBP对皮层神经元神经突起的生长;利用细胞免疫荧光法检测皮层神经元细胞中GAP43的表达;RT-qPCR法检测NBP对于皮层神经元细胞中GAP43基因水平表达。实验四,应用Western Blot测定GAP43,P-GAP43蛋白在NBP治疗中的作用:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham),溶剂对照组(Vehicle),NBP 20 mg/kg/d剂量组(NBP 20mg/kg/d)和NBP 40 mg/kg/d剂量组(NBP 40mg/kg/d)。分别于术后3天、7天、14天和28天通过蛋白印记法(Western Blot)测量GAP43,磷酸化的GAP43(P-GAP43)蛋白在NBP治疗中的作用。结果:1.NBP促进脑梗死后恢复期对侧皮层轴突向梗死侧皮层再生通过术后第4周脑组织切片BDA免疫组化染色和BDA免疫荧光染色,发现梗死周围皮层内存在从健侧过来的的轴突纤维,且NBP组梗死周围皮层内轴突纤维有增多的趋势。表明NBP促进轴突纤维从健侧向梗死侧皮层生长。2.NBP促进脑梗死后亚急性期和恢复期梗死周围皮层轴突可塑性恢复术后14天和28天,通过免疫荧光共聚焦技术(Confocol Technique)共染SMI312和GAP43,发现与Vehicle组相比,在梗死周围皮层NBP组GAP43促进轴突向梗死中心生长的趋势更明显。说明NBP促进脑梗死后亚急性期和恢复期梗死周围皮层轴突可塑性恢复。3.NBP可以增强原代培养的神经元细胞神经突起的生长药物作用于神经元细胞24小时后用β-Tubulin免疫荧光细胞化学染色法测定NBP对皮层神经元神经突起的生长,发现与对照组相比,1μM、10μM和100μM的NBP组能够明显促进神经元神经突起的生长(P<0.05),结果具有统计学差异。提示NBP可以增强原代培养的神经元细胞神经突起的生长。从结果上看,10μM的NBP组对神经突起的生长作用更加明显,因此,后续实验选用NBP浓度为10μM进行。4.NBP通过调节GAP43实现对皮层神经元神经突起生长的促进作用免疫荧光法显示,绿色荧光为β-III tubulin染色的皮层神经元细胞,红色荧光为GAP43染色的荧光。结果显示:绿色荧光与红色荧光能够叠加,表明皮层神经元细胞中存在GAP43的表达,这提示GAP43可能对调节皮层神经元神经突的生长具有生物学效应。用RT-q PCR法检测细胞中GAP43的变化情况。结果显示:与对照组相比,NBP对GAP43 mRNA表达有所升高,差异具有明显的统计学意义(P<0.05)。该结表明,NBP可能通过调节GAP43实现对皮层神经元神经突起生长的促进作用。5.NBP在脑梗死后不同时期对于GAP43和P-GAP43蛋白水平的测定NBP不引起脑梗死后梗死侧皮层GAP43蛋白水平的变化小鼠梗死后脑组织蛋白水平测定结果示:GAP43无论在术后3天、7天、14天和28天,Sham组,Vehicle组、NBP(20mg/kg/d)组和NBP(40mg/kg/d)组均无明显差异(P>0.05)。NBP促进脑梗死后急性期和亚急性期梗死侧皮层P-GAP43蛋白水平的增加:与Vehicle组小鼠相比,NBP 20mg/kg/d组的P-GAP43蛋白在术后3天、7天和14明显增加(P<0.05)。NBP 40mg/kg/d组蛋白P-GAP43在术后3天和7天明显低于NBP 20mg/kg/d组(P<0.05)。P-GAP43在术28天,Sham组,Vehicle组和NBP组均无明显差异(P>0.05)。说明P-GAP43蛋白水平在脑梗死后恢复期已经趋于稳定,不再发生变化。综上所述,NBP引起脑梗死后急性期和亚急性期梗死侧皮层P-GAP43蛋白水平的增加,而不引起脑梗死后梗死侧皮层GAP43蛋白水平的变化,提示NBP通过调节P-GAP43对皮层轴突再生发挥作用。结论:1.发现术后1小时连续腹腔注射20mg/kg/d NBP可以显著提高小鼠的神经功能恢复,提示NBP有脑保护作用。2.NBP延迟治疗可以明显改善实验性梗死小鼠的神经功能情况,提示NBP延迟治疗仍然具有脑保护作用。3.NBP可以改善脑梗死后亚急性期梗死侧皮层脑血流量,但不引起对侧皮层血流量变化。4.NBP干预可以使小鼠梗死中心和梗死周围皮层树突分级分支显著增多。NBP可以促进梗死周围皮层树突棘密度、树突棘长度和头部宽度增长。通过染色观察到NBP可以提高梗死周围皮层的树突和轴突向梗死中心生长的趋势,提示NBP有促进神经可塑性的作用。5.通过BDA染色法,发现NBP可以促进健侧皮层神经元轴突向患侧皮层生长的趋势。通过免疫荧光染色法发现NBP有促进患侧梗死周围皮层神经元轴突向梗死中心生长的趋势。6.在大脑皮层神经元原代培养方面,发现NBP可以促进细胞神经元突起的生长,细胞免疫荧光法检测到GAP43在皮层神经元细胞中可以表达,并通过RT-qPCR法检测细胞中GAP43的变化情况,提示NBP通过调节GAP43实现对皮层神经元的神经突起生长的作用。7.NBP可以上调P-GAP43蛋白的表达,而总的GAP43蛋白表达量没有变化,提示NBP可能是通过促进P-GAP43的增高来增强神经可塑性机制的。