登革病毒(DV)是黄病毒科黄病毒属成员,包含四个血清型,通过伊蚊传播。DV感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病,几乎在所有的热带、亚热带地区都有分布。登革病毒感染后可导致登革热、登革出血热、和登革休克综合征。据WHO估计,全球有25～30亿人口面临感染登革病毒的危险,每年因登革病毒感染死亡的人数是2.5万。关于登革病毒及其感染还有许多迄今未了解和解决的问题,严重制约了登革病毒疫苗的研制,因此至今尚无安全有效的疫苗推广应用。在感染性克隆技术基础上发展而来的嵌合病毒技术为黄病毒疫苗的研究提供了—条新的思路。乙脑病毒与登革病毒都同属黄病毒科黄病毒属的成员,为单股正链RNA病毒,基因组长约11kb,含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5’NCR—C-PrM/M-E-NS1-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR3’,共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中prM/E基因编码的M蛋白及E蛋白是病毒的膜蛋白,与诱导产生中和抗体有关,非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。乙脑病毒SA14-14-2株是我国自行研制的减毒活疫苗株,具有良好的安全性。本研究的主要目的是以SA14-14-2为基因骨架,用DV2病毒的prM/E基因替换其相应基因,构建乙脑/登革2型病毒,为研制登革病毒新型疫苗进行探索。本课题组既往已成功构建JEV SA14-14-2株的感染性克隆pBRF,本研究在此基础上,将结构蛋白prM/E基因缺失,替换为多克隆位点,以插入外源基因。为了避免引起致死性的删除,在缺失结构蛋白时,采取了两种方案：一种完全缺失prM/E基因,获得的载体命名为pFull△prM/E;另一种保留了E蛋白C端的71个氨基酸,因为这部分序列为NS1蛋白的信号肽序列,对于NS1蛋白表达与分泌可能会有影响,获得的载体命名为pPartial△prM/E。序列分析结果表明,构建的两个复制子载体都保留了NS2B-63、NS3-105、NS4A-225这3个位于非结构蛋白上的可能减毒位点。为了解所构建复制子载体pFull△prM/E及pPartial△prM/E的自主复制能力及表达外源蛋白的能力,我们进行了如下研究：(1)pFull△prM/E及pPartial△prM/E经单酶切线性化后,通过体外转录获得RNA。将RNA转染BHK细胞,并于转染后24h、48h、72h、96h收获细胞,提取RNA后反转录合成cDNA。每一时段的cDNA实施real time PCR检测,结果发现RNA拷贝数持续增加,以96h后增加倍数最多。表明构建的两个复制子均具有自主复制能力。(2)在pFull△prM/E Replicon和pPartial△prM/E Replicon载体的多克隆位点处插入YFP报告基因,并将带报告基因的体外转录RNA转染BHK细胞,结果在荧光显微镜下,可以看到荧光信号的持续增强。于转染后24h、48h、72h、96h收获细胞,流式细胞仪检测结果显示表达YFP的阳性细胞率逐渐增加,与镜下观察结果一致。表明所构建的两个复制子载体均能表达外源蛋白。在上述研究的基础上,进一步构建了乙脑/登革2型嵌合体克隆,并对嵌合病毒进行了拯救。采用RT-PCR技术获得DEN2(NGC株)的prM/E全长基因以及去除了prM/E基因3’端213nt的基因片段(1770nt)。前者克隆入pFull△prM/E载体,后者克隆入pPartial△prM/E载体(将登革prM/E基因C端的71个氨基酸替换为乙脑的相应部位),获得了pJED2及pJED2-1770两个嵌合体克隆。将pJED2及pJED2-1770采用单酶切线性化后,体外转录获得RNA,用RNA转染BHK细胞,与转染后5-7天可观察到典型的CPE,成功拯救出了两株嵌合病毒JED2V和JED21770V。(?)哿收集的P1代毒在BHK-21细胞中作连续传代,结果盲传5代均不能检测到病毒。而在C6/36细胞中培养的嵌合病毒JED2V及JED21770V可使细胞在感染5天左右出现典型病变,RT-PCR、IFA、Weston-blot鉴定结果表明所拯救的病毒具有嵌合RNA,能表达DV2的包膜蛋白。将嵌合病毒免疫Balb/C小鼠,四周后收集小鼠血清行抗DV2E蛋白IgG抗体及血清中和抗体效价检测,结果表明,嵌合病毒能使Balb/C小鼠产生特异的抗DV2E蛋白IgG抗体,血清中和抗体效价达1：10左右。进一步地,以乳鼠为实验对象,观察了嵌合病毒对乳鼠的神经毒力。将嵌合病毒JED2V、JED21770V及DV2、JEV从10-5TCID50/200ul开始,做10倍系列稀释,共设5个剂量梯度,每种病毒的每个剂量均脑内接种乳鼠,连续观察14天。各组小鼠的平均存活时间及相同剂量情况下的不同病毒组别间的生存曲线的Log-rank检验结果显示,两株嵌合病毒在各剂量水平的生存率均低于JEV相应组别(p<0.05)；与DV2相应组别比较,在有的剂量水平,生存率没有显著差异,而在有的剂量水平,生存率也较低(p<0.05)。说明我们获得的两株嵌合病毒并非减毒株。综上所述,本研究成功构建了JEV SA14-14-2株SA14-14-2株的复制子载体,并引入了方便外源基因克隆的多克隆位点,构建的JEV复制子载体经证实具有自主复制能力和表达外源基因的能力,为JEV载体的进一步应用奠定了基础。在此基础上成功拯救的乙脑/登革2型嵌合病毒具有嵌合的核酸、能表达DV2包膜蛋白、并能使Balb/C小鼠产生特异的抗DV2E蛋白抗体,尽管未得到理想的减毒效果,却也为采用反向遗传学技术研究登革病毒新型疫苗进行了有益的探索。随着研究的深入,可将获得的嵌合体感染性克隆作系列定点突变,以期获得减毒嵌合病毒,同时也可在一定程度上作为乙脑病毒及登革病毒致病机理的分子模型。