目的多发性骨髓瘤(Mutiple myeloma,MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。在我国,MM的年发病率为1/10万,西方工业化国家的年发病率为4/10万。在美国,MM的年发病人数为14000人。到目前为止,MM仍然是一种不能治愈的肿瘤,平均生存期3年,占造血系统肿瘤死亡率的20%。目前,多发性骨髓瘤(MM)的主要治疗方法仍为联合化疗和自体造血干细胞移植,由于MM的平均发病年龄为55岁,且50%～70%伴有肾损害,因此多数病人没有造血干细胞移植的机会,只能接受联合化疗。过去,MP、VAD、M2是MM主要的化疗方案,治疗有效率42%～50%,1999年以来,反应停用于MM治疗,反应停+地塞米松方案治疗初治MM的有效率64%～74%。2001年,在反应停的类似物Lenalidomide的Ⅱ期临床试验中,Lenalidomide+地塞米松的有效率为91%。Bortezomib第一个临床应用的蛋白酶体抑制剂,单药治疗耐药及复发MM的有效率分别为33%和50%。虽然近年来MM的治疗取得了长足进展,但是MM仍然是一种不能治愈的肿瘤。因而有必要探索更加有效的治疗药物。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是Wiley SR在1995年发现的肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)超家族成员。在体外和小鼠体内实验均证实,TRAIL能快速、有效地诱导肿瘤细胞凋亡,而对大多数正常组织细胞没有毒性。因此,TRAIL用于肿瘤治疗的可能性激起许多研究者的兴趣。目前,美国和中国都已经批准了TRAIL的临床实验,有关TRAIL对血液系统肿瘤特别是多发性骨髓瘤的作用研究很少。本研究以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,从两个方面观察TRAIL的作用:第一,TRAIL对骨髓瘤细胞株RPMI8226黏附分子表达的影响;第二,TRAIL对多发性骨髓瘤细胞株的促凋亡作用。初步探讨TRAIL对人多发性骨髓瘤的作用机制,为TRAIL作为一种新型的抗肿瘤生物制剂治疗多发性骨髓瘤提供理论基础。方法1细胞培养和传代1.1人类多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的培养和传代人类多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226,培养于含体积分数为20%的灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、体积分数为5%的二氧化碳的培养箱中培养,每5～6天传代一次,实验用对数生长期细胞,台盼蓝染色拒染率均在95%以上。1.2人骨髓基质细胞的培养从健康志愿者髂前上棘后1cm处骨穿抽取1ml的骨髓,将骨髓液进行全骨髓培养,用含10%FBS LG-DMEM培养基,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml。37℃、5%CO2孵育箱中培养,不同时间点弃悬浮细胞,用0.01mmol/L PBS(PH=7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%FBS LG-DMEM培养基培养,对于贴壁的细胞进行传代培养。2 TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226黏附分子表达以及对人骨髓基质细胞生长抑制率影响的研究2.1 MTT法检测TRAIL对BMSCs细胞生长抑制率的影响取对数生长期的BMSCs,调整细胞密度为2×105/ml,接种于96孔平地培养板中,待24小时BMSCs单层汇合后,分别加入不同浓度的TRAIL,培养不同的时间(最长时间为96小时),培养结束前6h加入20μl MTT(5μg/ml);离心培养板,小心吸去上清,加入DMSO 200μl,振荡溶解还原的formazon结晶,酶标仪(Multiskan、Ascent Labsystems)550nm测A值,绘制细胞生长曲线。2.2流式细胞术检测TRAIL对RPMI8226细胞表面粘附分子CXCR4表达率的影响取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为2×105/ml ,接种于24孔培养板,加入不同浓度TRAIL作用24小时后,收集细胞,用冷PBS洗两遍后,各取细胞悬液100μl,分别加入CD184(CXCR4)6ul,对照组加入CD4 6ul,轻轻混匀,室温避光反应30分钟,立即在流式细胞仪(FACSCallibur)上检测,计数104细胞,以对照管作为阴性对照,CELLQuest软件分析,粘附分子CD184(CXCR4)表达水平以阳性细胞百分数表示。3 MTT法检测不同浓度TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞悬液,以不同浓度的TRAIL处理不同的时间,培养结束前6小时加入20μl MTT(5μg/ml);离心培养板,小心吸去上清,加入DMSO 200μl,振荡溶解还原的formazon结晶,酶标仪(Multiskan、Ascent Labsystems)570nm测A值,绘制细胞生长曲线。4 TRAIL对诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡作用的研究4.1AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒检测TRAIL作用前后细胞早期凋亡率的变化。取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为2×105/ml,接种于24孔板,每孔2ml,以不同浓度的TRAIL处理24小时后,收集培养细胞,4℃PBS洗两遍后,重悬于200μl的Binding Buffer,加入FITC标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)10μl和PI(碘化丙啶)5μl,轻轻混匀,4℃避光反应30分钟,加入300μl Binding Buffer ,立即在流式细胞仪上检测,计数104个细胞,用CELLQuest软件分析细胞凋亡率。4.2半定量逆转录-聚合酶链反应(semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测不同浓度TRAIL作用于人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 24h前后凋亡基因表达的变化。4.3 Western blot方法检测不同浓度TRAIL作用于人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226前后凋亡蛋白的变化。用Western blot法检测TRAIL作用于RPMI8226细胞前后NF-κB P65、caspase-3、Mcl-1的蛋白表达:RPMI8226细胞培养48小时后,收集细胞,加5倍体积的RIPA裂解缓冲液(50mol/L Tris-HCl,pH7.5,150mmol/L NaCl,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,l mmol/L EDTA,l mmol/LPMSF,2mg/L Leupeptin),4℃,作用1h,离心、取上清,Lowry法测蛋白含量。灌制8%的分离胶和5%的浓缩胶。取相当于150μg蛋白的细胞提取液,与等体积上样缓冲液混匀后,100℃沸水浴煮3min,自然冷却后上样于凝胶加样孔内,120V恒压电泳。将NC膜用转移缓冲液(50mmol/L Tris,40mmol/L甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇)浸润后,覆盖于凝胶上面,置入转移槽中,NC膜位于正极,凝胶位于负极。4℃,80～90V恒压转移3h。转膜完毕,取出NC膜,置于含5%脱脂奶粉、1%BSA的TTBS(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,150mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)封闭液中,4℃封闭过夜。加适量以TTBS稀释为适当浓度的一抗(小鼠抗人NF-κB P65单克隆抗体、小鼠抗人caspase-3单克隆抗体、兔抗人Mcl-1多克隆抗体)(1:200),室温反应2h。用TTBS洗膜,3×10min。加适量以TTBS稀释为1:1500的二抗(辣根酶标记抗鼠IgG、辣根酶标记抗兔IgG),于室温反应1h。用TTBS洗膜3×10min,TBS洗膜1×10min,滤纸吸干NC膜表面的水份。按照ECL发光试剂盒说明书进行。将膜放入平皿中,加入发光剂,轻轻摇动1min;将膜取出,用滤纸吸干,保鲜膜包好。按照从下至上依次为NC膜、X光片和增感屏的顺序,放于暗盒中,曝光3min后,进行显影、定影及灰度扫描分析。结果1 TRAIL影响人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226粘附分子的表达1.1 TRAIL对人骨髓基质细胞,仅有轻度杀伤作用;人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和人骨髓基质细胞共同培养24h后,比单纯RPMI8226细胞生长状态良好,增殖旺盛。1.2随着TRAIL浓度增加,处理24h后的RPMI8226细胞表面粘附分子CD184表达率逐渐升高。2 TRAIL抑制了RPMI8226细胞株的增殖,并且呈现时间剂量依赖性。TRAIL浓度为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml时,48h的细胞增殖抑制率分别为46%、54%、59%;72h的细胞增殖抑制率分别为48%、57%、63%;96h的细胞增殖抑制率分别为61%、69%、72%。3 TRAIL可诱导人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡3.1 TRAIL作用后细胞形态学变化:光镜观察TRAIL作用24h后, RPMI8226细胞出现染色质浓缩、空泡化;染色质高度凝聚、边缘化;细胞核固缩、核碎裂、凋亡小体出现等细胞凋亡的形态学改变。对照组(不加TRAIL组)细胞则形态完整,核物质分布均匀,细胞无凋亡形态学改变。3.2 TRAIL影响RPMI8226细胞的凋亡率:用TRAIL处理RPMI8226细胞24h后,细胞凋亡率增加。TRAIL浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml和10μg/ml时,细胞的凋亡率分别为43.50%、59.76%、68.24%、71.01%和79.43%。呈现明显的量效关系(P<0.05)。3.3 TRAIL作用24h后,随着TRAIL浓度增加,RPMI8226细胞内的抗凋亡基因Mcl-1、XIAP和cFLIPmRNA表达水平明显下降;CARP1、CARP2和bcl-2mRNA表达水平则呈现逐渐下降趋势;促凋亡基因Bax mRNA表达水平呈逐渐增强趋势。3.4 TRAIL作用48h后,RPMI8226细胞内的凋亡执行蛋白caspase-3和NF-κB P65(RelA)表达水平随着TRAIL浓度的增加而呈现逐渐下降趋势;而Mcl-1的表达水平在TRAIL作用前后及不同浓度的TRAIL作用下无明显增强或减弱趋势。结论1 TRAIL对人骨髓基质细胞,仅有轻度杀伤作用;人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和人骨髓基质细胞共同培养24h后,比单纯培养RPMI8226生长状态旺盛。2 TRAIL上调人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面的粘附分子CXCR4表达水平。3在一定的浓度范围内, TRAIL对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长抑制呈时间-剂量依赖性。4细胞形态学观察和AnnexinⅤ/PI法证实了TRAIL可以诱导人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡。同时发现TRAIL作用前后人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226内的凋亡相关基因和蛋白水平发生了变化,我们推测TRAIL诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制可能是抑制了抗凋亡基因CARP1、CARP2、Bcl-2和凋亡相关蛋白caspase-3和NF-κB P65的表达,并引起促凋亡基因Bax的表达,引发细胞凋亡。