论文部分内容阅读
目的:评价可降解高分子低聚物胆固醇-g-聚乳酸(Cholesteryl oligo-graft-lactic acid,CLA)的液晶态结构对成纤维细胞粘附、增殖以及表型转化的作用;分析材料CLA降解与液晶态结构改变、细胞凋亡之间的相关性。方法:(1)以开环聚合法,按胆固醇与丙交脂投料比为1:1.5、1:2.5、1:3.5分别制备3种不同胆固醇接枝度的CLA产物CLA1:1.5、CLA1:2.5、CLA1:3.5;以傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱对产物进行结构分析;以偏振光显微镜检测产物的液晶态结构;以差示扫描量热法和凝胶渗透色谱分别测定产物的液晶相温度区间和相对分子质量。(2)分别以牛肌腱胶原、聚乳酸(Polylactic acid,PLA)、不同胆固醇接枝度CLA为材料制备细胞生长基质,以无高分子材料膜空白培养板为空白对照,通过CCK-8试剂盒检测膜材料对成纤维细胞粘附和增殖的影响;以α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达为指标,通过免疫荧光法和免疫印迹法分析膜材料对成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的影响。(3)通过PBS孵育方式降解不同胆固醇接枝度CLA,分别以示差量热扫描、偏光显微镜观察等方法分析孵育时间与不同胆固醇接枝度CLA相变温度和液晶相结构改变间的关系;采用TUNEL法与Annexin V-PI双染法检测降解后的CLA薄膜对细胞凋亡的影响;分析材料降解与液晶态结构改变、成纤维细胞凋亡之间的相关性。结果:(1)开环聚合得到的3种CLA产物CLA1:1.5、CLA1:2.5和CLA1:3.5均为淡黄色粘性固体,相对分子质量分别为793±140、1320±123和1366±146;三种CLA与胶原基质在37℃时均处于液晶态,显示出明显的流动性和光学双折射性质;PLA无液晶相。(2)细胞接种4 h后,CLA1:3.5的细胞粘附与空白组无显著差异(P>0.05);CLA1:1.5和CLA1:2.5的细胞粘附显著高于空白组和PLA组(P<0.05),与胶原组无显著差异(P>0.05)。细胞接种24 h后,CLA1:1.5、CLA1:2.5和CLA1:3.5的细胞增殖均显著高于空白组(P<0.01),与胶原组无显著差异(P>0.05);不同胆固醇接枝度的3组CLA间无显著差异(P>0.05);所有实验组间α-SMA表达均无明显差异(P>0.05)。细胞接种48、72 h后,CLA1:3.5的细胞增殖与空白和PLA组无显著差异(P>0.05);CLA1:1.5和CLA1:2.5的细胞增殖均显著高于空白组(P<0.01),与胶原组无显著差异(P>0.05);三种CLA的α-SMA表达均显著高于空白组和PLA组(P<0.05),与胶原组无显著差异(P>0.05);不同胆固醇接枝度的3组CLA间α-SMA表达无显著差异(P>0.05)。(3)偏光显微镜观察聚合物CLA经PBS孵育后液晶相改变,其中CLA1:1.5和CLA1:2.5在孵育72 h时其液晶态结构基本消失,而相对分子质量较大的CLA1:3.5则在96 h时消失。以TUNEL和Annexin V-PI双染法检测CLA液晶相改变对细胞凋亡的影响,孵育了不同天数的CLA1:3.5的细胞凋亡均显著高于空白组和PLA组(P<0.05),细胞凋亡与孵育时间呈正相关(P<0.01);CLA1:1.5和CLA1:2.5孵育72 h前的细胞凋亡显著高于空白组和PLA组(P<0.05),并与孵育时间呈正相关(P<0.01),而孵育96 h的细胞凋亡与空白组无显著差异(P>0.05);在同一时间比较各组凋亡情况,发现在液晶态未消失前,细胞凋亡与胆固醇接枝度呈相关(P<0.05)。结论:丙交酯与胆固醇开环共聚产物CLA具有液晶相结构;聚合物材料的液晶态结构有利于成纤维细胞粘附与增殖,且对其向肌成纤维细胞的表型转化具有明显的促进作用;聚合物CLA的液晶相结构随着聚合物降解逐渐消失,其液晶相结构的消失可诱导成纤维细胞的凋亡。上述结论提示:可降解的液晶态高分子材料可为增生性瘢痕的治疗和预防提供了一个新的视角,具有较好的应用前景。