中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位研究

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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国特有的水产珍品,也是我国一种重要的经济蟹类,广泛存在于我国南北各地淡水水域中。中华绒螯蟹是我国名优淡水养殖业的主要品种。近年来,其养殖业在沿海各地蓬勃兴起,它以优良的生物学品质,极高的营养价值和独特的风味蜚声海内外。养殖业的发展,进一步促进了基础科学研究的发展,而基础科学的发展,又反过来加速了养殖业的蓬勃发展。 本文就中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位进行了研究,为其受精生物学、发育生物学方面的深入研究提供参考资料。主要从以下几个方面进行了研究: 1.对中华绒螯蟹雄性生殖系统进行解剖,得到贮精囊,进而分离到精荚,利用玻璃匀浆器匀浆的方法,对中华绒螯蟹精荚进行破碎,得到精荚基质和精子;使用两种去污剂对中华绒螯蟹精子膜蛋白进行了提取,在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件下,对其精子膜蛋白组分进行了分析,实验结果表明,在双去污剂作用下,提取得到的精子膜蛋白与脱膜精子部分蛋白谱带差异明显;并对提取的精子膜蛋白进行了分子量、等电点和糖蛋白检测,结果显示,所提取的12种精子膜蛋白,其分子量均在100ku以下,等电点范围在4.4-6.2之间,并均为糖蛋白,说明所提取的中华绒螯蟹精子膜蛋白是低分子量的酸性糖蛋白,这与其他一些哺乳动物精子膜蛋白的研究结果类似; 2.乳酸脱氢酶(LDH)尤其是精子特异性乳酸脱氢酶,定位于膜上,也为精子膜蛋白的一种。利用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和特异性染色的方法,对中华绒螯蟹进行了乳酸脱氢酶同工酶电泳分析,实验结果表明,以两种不同底物(乳酸钠和α-羟基丁酸钠)分别作用于血清、鳃、心脏、肌肉、肝胰腺、成熟蟹精巢、未成熟蟹精巢和精子,实验结果显示,乳酸脱氢酶同工酶具有组织特异性,并且首次在中华绒螯蟹体内发现了精子特异性乳酸脱氢酶,这种酶在中华绒螯蟹精子成熟过程中均存在,并随着精子的成熟,其含量和酶活性逐渐增强,可能在精子成熟过程中起作用; 3.利用抽提的精子膜蛋白免疫雌性新西兰白兔,制备多克隆抗血清;利用琼脂糖双向免疫扩散分别对多克隆抗血清活性、效价进行了分析,实验结果表明,制备的多克隆抗血清发生抗原抗体沉淀反应,具有免疫活性,且其效价为1:16;在精子膜蛋白雌雄组织特异性检测中,其实验结果表明,制备的多克隆抗血清与精巢、输精管和贮精囊粗提
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