应用60Co-γ射线诱变技术筛选富油微藻藻株

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针对野生微藻藻株油脂含量低、生长速度慢及生物量低的瓶颈问题,本文采用60Co-γ射线诱变育种技术促使微藻细胞发生诱变,从中筛选出高含油微藻突变株,以丰富优质藻种的资源。重点阐述了在最佳的诱变剂量范围内,应用60Co-γ射线诱变出发藻株并筛选富油微藻突变株的方法;对突变藻株的多相分类学进行了系统的分析,更加明晰了其种属特性;对突变藻株的生长和产油条件进行了优化,建立了油脂高效积累的调控策略;对诱变前后藻株的差异进行多尺度解析以探讨诱变后微藻油脂含量增加的机制,以期为微藻的规模化培养和生物柴油技术的发展提供理论支持和技术指导。野生微藻Scenedesmus.MC-1经60Co-γ射线诱变后,通过对诱变剂量范围的优化,确定了最佳的诱变剂量为100Gy,并筛选到一株富油微藻突变株Scenedesmus.Z-4,其油脂含量和生物量分别为29%和3.0g/L,相比于出发藻株MC-1的相应指标(18%,2.3g/L),分别提高了约60%和30%。实验中还发现,低剂量的60Co-γ射线对于藻细胞的生长和油脂积累具有促进作用。微藻突变株可以利用多种碳源,如葡萄糖、果糖和乙酸钠等进行生长和油脂积累。诱变前后,藻株的18S rDNA未发生改变,长度为1292bp。经系统进化分析,藻株与Scenedesmus sp. R-16和Scenedesmus abundans的18S rDNA最为接近,同源性达100%,属于栅藻属(Scenedesmus)。突变藻株Z-4可以利用葡萄糖进行高效产油,采用间歇培养实验确定了最佳的生长和产油条件,最佳条件为葡萄糖10g/L,硝酸钠0.8g/L,磷酸氢二钾0.04g/L,pH值7.0-7.5,光暗周期比12:12,在此条件下油脂含量和生物量可达38.5%和3.9g/L。突变株和出发藻株相比,在以下几方面表现出了不同程度的差异:1)突变藻细胞的形态学特征发生了改变,其形体更大,表面更加粗糙。结合表面官能团分析,C-OH和C=O这两种含氧官能团含量增多,认为是60Co-γ射线的辐照增加了其胞外多糖物质的分泌。2)突变藻株在细胞组成物质含量、生长速率、产油速率、pH耐受力等方面的优势对其生长和油脂积累产生了积极的作用。同时,突变藻株可以利用廉价的底物乙酸钠进行高效产油,这对于微藻生物柴油技术降低生产成本、加快产业化步伐具有更大的实际意义。3)利用聚合酶反应连接的限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对油脂合成中的关键基因—乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因进行了差异分析,两株微藻的这两个基因经扩增、酶切后的电泳图谱并不相同,说明突变藻株的基因序列在酶切位点附近发生了变化。结合基因测序的结果,突变藻株在ACCase基因的318bp和456bp处、PEPCase基因的117bp处分别发生了突变,这些基因的改变可能影响了两种酶的活性,从而使得微藻突变株合成油脂能力得到了提升。
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