论文部分内容阅读
细胞壁完整性(Cell wall integrity, CWI)信号通路是真菌中普遍存在一条保守通路,在生长、繁殖、对逆境胁迫的感受和调节中均具有重要作用。Rho1蛋白作为CWI通路的主要调节因子能够与膜传感器信号整合后激活下游MAPK信号通路,参与细胞壁合成等多种生理调控。罗伦隐球酵母是目前广泛报道的一种用于果实采后病害的生防酵母,但因其遗传背景尚不明确,导致其在基因水平上研究进展缓慢。本课题通过转录组技术获得罗伦隐球酵母的rhol基因序列,在序列分析的基础上通过酿酒酵母表达系统异源表达罗伦隐球酵母rhol基因,探究rho1基因转化在提高重组酵母抗逆性和生防效力方面的可行性,研究结果对于明确rho1在生防酵母逆境适应和抑制果实病害中的作用等具有重要意义。主要研究结果如下：罗伦隐球酵母rho1基因序列和所编码的蛋白结构分析。通过对罗伦隐球酵母转录组高通量测序分析获得rho1基因的cDNA序列为597 bp,运用PCR扩增得到rho1基因全长966 bp,包含7个外显子和6个内含子,在基因结构上与新型隐球酵母及其相似；对罗伦隐球酵母Rho1蛋白结构预测结果显示：Rho1蛋白由199个氨基酸组成,存在典型小GTP结合蛋白保守结构域,并有6个α1-螺旋结构、6个p-折叠和5个Loop结构,与已知的Rho家族蛋白空间结构相似,因此推断罗伦隐球酵母Rho1蛋白与已知Rho家族蛋白可能具有相似的生物学功能。罗伦隐球酵母rho1基因克隆及在酿酒酵母中表达。用特异性引物扩增得到rho1基因cDNA全长序列,利用Clonexpress高效的DNA定向克隆技术将rho1基因连接到载体上,并将重组载体通过电转化导入酿酒酵母感受态细胞,在含有150μg/ml的杀稻瘟菌素的培养基筛选得到转化子,测序鉴定后构建重组酿酒酵母SC-rho1。重组酿酒酵母SC-rho1抗逆性和生防效力评价。重组酿酒酵母对温度和渗透压的耐受性明显高于野生型酿酒酵母,同时在37℃和渗透压胁迫下重组酿酒酵母能更加有效抑制梨果实病害,与野生型酿酒酵母相比分别将发病率降低了33%和25%,其机理可能与rho1基因过表达后提高CWI信号通路的转录效率有关。