肿瘤具有明显的异质性。肿瘤实质中,不同肿瘤细胞群体在增殖能力、分化程度、侵袭能力以及治疗抵抗性等多方面存在差异。在体外培养条件下,肿瘤细胞的克隆形成能力也存在异质性,这种异质性在体内可能表现为不同肿瘤细胞在成瘤能力上的差异。根据成瘤能力的差异,可以将肿瘤细胞分为不同的亚群,那部分具有高度成瘤能力的肿瘤细胞被称为肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)或癌症干细胞(cancer stem cells, CSCs),CSCs可分化形成大量无肿瘤形成能力的肿瘤细胞,即非成瘤性肿瘤细胞(non-tumorigenic cancer cells)。迄今为止,肿瘤干细胞在造血系统肿瘤以及多种实体瘤内被发现和证实,这部分细胞虽然为数极少,却可以自我更新(复制)和无限增殖,被认为是肿瘤发生、复发和侵袭转移的根源。胶质瘤是一类异质性十分显著的肿瘤。已经有较多的证据表明胶质瘤存在肿瘤干细胞即胶质瘤干细胞(Glioma stem cells, GSCs)。尽管胶质瘤干细胞的研究正在不断取得进展,但胶质瘤干细胞的分选仍是这一领域乃至肿瘤干细胞领域的一个基本而关键的问题。目前GSCs的分离或富集采用的方法多是利用流式细胞术或免疫磁珠技术对胶质瘤内的CD133+细胞进行分选,因为CD133+细胞经证实具有肿瘤干细胞的特性。另一种常用的方法则是根据干细胞高表达ATP结合盒(ATP-binding cassette)转运体的特点,通过流式细胞术从胶质瘤内分离出“侧亚群”(side population,SP)细胞,由于SP细胞经证实具有肿瘤干细胞的特性,因此筛选SP细胞也可以达到分选或富集肿瘤干细胞的目的。上述两种方法不仅需要一定的设备,对细胞的活力也有影响,而且敏感性和特异性也存有疑问。因此,寻找新的GSCs分选策略或方法十分必要。由于肿瘤干细胞与非成瘤性肿瘤细胞在分化程度、增殖能力上存在差异,所以体外培养时两者的克隆形成能力可能也会不同,并可能形成不同表型的克隆。有研究报道,头颈部鳞癌、乳腺癌以及前列腺癌细胞形成的克隆具有形态异质性,其中的一类形态规则紧密的克隆含有肿瘤干细胞,其成瘤能力很强,少至100个细胞即可在动物体内形成移植瘤,而其他类型的克隆无成瘤能力。因此,细胞克隆的异质性尤其是形态上的异质性可能有助于对肿瘤干细胞进行分选或富集。这种方法操作较简单,而且比较符合肿瘤干细胞的功能定义,为获得肿瘤干细胞提供了新的思路。但在胶质瘤是否存在克隆异质性,以及这种异质性是否可用于对GSCs的识别和分选,目前还未见文献报道,而且利用克隆形态的异质性对含有肿瘤干细胞克隆进行识别和分选的机制还从未被阐明。为解决上述问题,本研究以人恶性胶质瘤细胞系U251为模型,观测其克隆异质性并进行分类,初步筛选鉴定出GSCs克隆,并部分阐明了利用克隆形态异质性识别肿瘤干细胞克隆的机制。另外,我们还观测了人间变性星形少突胶质瘤的GSCs在动物体内的成瘤能力和分化特性,鉴定了其肿瘤干细胞特性。本研究共分为三个部分:第一部分,观测了U251细胞克隆形态及分化的异质性。本部分进行了U251细胞的克隆形成实验,发现其克隆形成率为7.88%。根据克隆形态将其分为紧密型,中间型和松散型三类。三种类型的克隆所占比例分别为11.9%,61.0%和27.1%。利用免疫细胞染色、激光共聚焦术观察克隆三种分化标记物GFAP,vimentin及nestin表达情况,结果发现紧密型克隆GFAP表达最弱,vimentin,nestin的表达最强;松散型克隆GFAP表达最强,而vimentin,nestin表达最弱;中间型克隆上述三种标记物均有一定程度表达,居于紧密型和松散型之间。第二部分,分离和鉴定了U251细胞系内GSCs克隆,探讨不同克隆形态发生机制。本研究利用克隆柱对分化程度最低的紧密型克隆进行分离,将细胞低密度接种再次进行克隆形成实验。结果显示来自紧密型克隆的细胞能再次形成紧密型克隆,具有自我更新能力,而且紧密型克隆的细胞除能复制自身的克隆类型以外,还可产生中间型和松散型克隆;将紧密型克隆细胞接种至干细胞培养基,可见其与神经干细胞类似,能形成悬浮生长的细胞球,免疫细胞染色显示细胞球表达CD133;将紧密型克隆形成的细胞球接种至含血清的培养基2周后,细胞球贴壁并发生分化,产生的细胞能分别表达神经系统三种细胞谱系的标志物GFAP、MBP和β-tubulinⅢ,而且部分细胞可同时表达GFAP和β-tubulinⅢ。本部分研究还通过损伤修复实验,细胞迁移实验比较了不同克隆内细胞的迁移能力,并利用免疫化学染色显示与迁移相关的细胞骨架微丝F-actin在细胞内的分布和排列方式。结果显示,来自紧密型克隆的细胞体外迁移能力低下,细胞骨架发育幼稚,F-actin排列紊乱,极性不明显,而来自松散型克隆的细胞在体外具有更强的迁移能力。另外,紧密型克隆CD44呈强阳性,其表达高于中间型和松散型克隆,提示CD44可能是紧密型克隆细胞侵袭能力较强的分子基础之一。第三部分,观察了人原发性间变性少突-星形细胞瘤GSCs在动物体内的成瘤能力。本部分利用从原代培养的人间变性少突-星形细胞瘤细胞中分离获得的GSCs进行异种移植,证明这些GSCs在体内成瘤后发生异质性分化,再现了混合性胶质瘤的生物学特性,并富含未分化细胞。以上三部分研究提示:1. U251细胞形成的克隆在形态和分化程度上具有异质性,存在紧密型、中间型、松散型三类克隆,其中紧密型克隆的分化程度最低。2.来自紧密型克隆的细胞具有自我更新、多向分化能力等肿瘤干细胞的特性;其体外迁移能力低下可能是此型克隆形态发生的重要机制之一。3. GSCs经异种移植成瘤后形成异质性分化的胶质瘤细胞,并富含未分化细胞。综上所述,利用细胞克隆的异质性可以分离鉴定GSCs,这为获得GSCs提供了一种新的简便易行的方法。