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目的1.观察再灌注时Zip7达上调是否通过抑制心肌细胞线粒体自噬来增加线粒体ROS的产生。2.探讨Zip7调控线粒体自噬的分子机制。方法用大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型和H9c2细胞缺氧/复氧模型,检测再灌注及复氧期Zip7的表达变化情况;构建Zip7敲除的杂合子小鼠,检测其胚胎组织中线粒体自噬标志蛋白TOM20的表达情况;利用H9c2细胞构建Zip7敲除及Zip7过表达的稳定细胞株;用Western blotting法检测TOM20、PINK1及Parkin的蛋白表达变化情况;利用Zip7 siRNA进行瞬时转染,检测TOM20蛋白表达;用Mitosox red荧光探针检测线粒体内超氧化物含量;用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（△Ψm）的变化情况;用细胞免疫荧光技术观察PINK1及Parkin在细胞内的定位;用Zinpyr-1锌离子绿色荧光探针检测细胞内锌离子含量;利用RNA-Seq测序技术检测并筛选Zip7基因敲除时自噬及线粒体自噬差异基因。结果1.QPCR及Western blotting结果显示,与对照组相比,大鼠心脏缺血/再灌注组Zip7的mRNA及蛋白表达均升高。与对照组相比,H9c2细胞缺氧/复氧组,Zip7 mRNA及蛋白表达均显著升高,而这一现象被特异性钙离子螯合剂BAPTA-AM、EGTA所抑制,表明缺氧/复氧时细胞钙超载可能诱导Zip7的表达上调。2.Western blotting结果显示,在生理条件下用CaCl2处理H9c2细胞后Zip7表达上调。3.Western blotting结果显示,H9c2细胞转染Zip7 siRNA后,与阴性对照组相比,TOM20蛋白表达明显减少;同样,Zip7敲除的杂合子胚胎组织中,TOM20蛋白表达也明显减少。敲除Zip7基因的H9c2稳定细胞株中,TOM20蛋白表达减少而Zip7过表达的稳定细胞株则显示TOM20蛋白表达增多,说明Zip7敲除可诱导线粒体自噬,而Zip7过表达则抑制线粒体自噬。此外,Western blotting结果显示,Zip7敲除的杂合子胚胎组织中,LC3Ⅱ/Ⅰ增多,P62蛋白表达减少;同样,Zip7基因敲除的H9c2稳定细胞株中,LC3Ⅱ/Ⅰ增多,P62蛋白表达减少;GFP-LC3荧光观察结果显示,Zip7基因敲除的H9c2稳定细胞株中GFP-LC3绿色荧光增多,提示Zip7敲除可诱导自噬。反之,Zip7过表达的稳定细胞株的LC3Ⅱ/Ⅰ减少,P62蛋白表达增多,提示Zip7过表达抑制自噬。4.Western blotting结果显示,缺氧/复氧时敲除Zip7基因导致TOM20表达明显降低,表明复氧时Zip7可能抑制线粒体自噬。5.Mitosox red荧光检测结果显示,在生理条件下,与野生型H9c2细胞相比,Zip7敲除的稳定细胞株线粒体ROS水平明显减少;过表达Zip7后,线粒体ROS增多。在缺血/再灌注条件下,敲除Zip7可抑制线粒体内ROS的产生。6.细胞免疫荧光和Western blotting结果显示,Zip7定位于线粒体。7.共聚焦影像结果显示,敲除Zip7后线粒体内锌离子明显增多。8.流式与共聚焦影像结果显示,与野生型H9c2细胞相比,Zip7基因敲除的H9c2细胞线粒体膜电位明显降低（去极化）;与空载对照组相比,Zip7过表达的H9c2细胞线粒体膜电位明显升高（超极化）,表明Zip7可能通过改变线粒体膜电位调控线粒体自噬。9.Western blotting结果显示,与野生型H9c2细胞相比,Zip7敲除的稳定细胞系中,胞浆和线粒体内Parkin表达增多,提示Zip7基因敲除通过PINK1/Parkin通路诱导线粒体自噬。10.免疫荧光实验结果显示,与野生型H9c2细胞相比,Zip7敲除的H9c2细胞内PINK1,Parkin与线粒体的共定位增多,表明Zip7基因敲除可能通过线粒体去极化诱导PINK1/Parkin在线粒体的聚集。11.荧光定量PCR实验结果显示,与Zip7基因敲除组相比,转染Parkin siRNA后TOM20 mRNA水平明显升高,表明敲降Parkin可抑制Zip7基因敲除所诱导的线粒体自噬,进一步明确Zip7通过PINK1/Parkin通路抑制线粒体自噬。结论1.心肌缺血/再灌注或缺氧/复氧时Zip7的表达增加。2.Zip7过表达可能通过抑制线粒体自噬来增加线粒体内ROS产生,进而引起心肌损伤。3.Zip7通过PINK1/Parkin信号通路调控心肌细胞线粒体自噬。