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目的：探讨免疫组化及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)在膀胱低级别非浸润性内翻生长型尿路上皮癌(urothelial carcinoma, UC)及内翻性乳头状瘤鉴别诊断中的应用,为临床实际工作提供参考。在浅表性及肌肉浸润性UC中免疫组化方法检测Ki-67和CyclinD1蛋白的表达,FISH检测3、7、17号染色体扩增及9p21纯合性缺失情况,分析它们与临床病理参数及预后的相关性。材料与方法：第一部分收集复旦大学附属肿瘤医院病理科及复旦大学附属华东医院病理科膀胱内翻生长性肿瘤74例,包括膀胱内翻性乳头状瘤36例,低级别非浸润性内翻生长型UC38例。显微镜下观察并比较肿瘤的组织学特点。制备组织芯片(tissue microarray, TMA),免疫组化方法检测Ki-67、CK20、p53和CyclinD1蛋白的表达情况,用UroVysion试剂FISH方法检测肿瘤中3、7、17号染色体扩增及9p21缺失情况。统计分析上述蛋白及染色体异常在膀胱内翻性乳头状瘤及内翻生长型UC中的差异。第二部分收集复旦大学附属肿瘤医院UC250例,其中包括浅表性UC126例(Ta53例,T173例),肌肉浸润性UC124例。收集相关的临床病理资料以及预后资料。用10例非肿瘤性尿路上皮做阴性对照。免疫组化方法检测Ki-67和CyclinD1蛋白的表达情况,FISH方法检测肿瘤中3、7、17号染色体扩增及9p21缺失情况,统计分析上述蛋白及染色体异常与浅表性UC和肌肉浸润性UC临床病理参数及预后的关系。结果第一部分1.形态学分析：内翻性乳头状瘤以相互连接的细胞索为主,细胞索较细且宽度均匀,或者以大小较一致的细胞巢为主,细胞巢较小,巢中央可有囊性结构。31/36(86.1%)病例中瘤细胞索或巢的外侧细胞呈栅栏状排列,28/36(77.8%)病例中细胞索或巢内部的细胞为流水线状排列。核分裂像罕见或无,并且分布于基底层,本研究中核分裂像均少于1/10HPF。内翻生长型UC细胞索往往较粗且宽度不一,而细胞巢通常较大且大小不等。在细胞索或细胞巢的内部17/38(44.7%)病例可找到肯定的纤维血管轴心。核分裂像较多,20/38(52.6%)病例中>1/10HPF,且常见于表层和中间层细胞。2.免疫组化结果：1)Ki-67在内翻性乳头状瘤中的阳性表达率(1/36,2.8%)显著低于内翻生长型UC(18/38,47.4%),其差异有统计学意义(P<0.001)。CK20在内翻性乳头状瘤中的阳性表达率(2/36,5.6%)显著低于内翻生长型UC(14/38,36.8%),其差异有统计学意义(P=0.001)。P53在内翻性乳头状瘤中的阳性表达率(10/36,27.8%)较内翻生长型UC(16/38,42.1%)低,但其差异无统计学意义(P=0.230)。CyclinD1在内翻性乳头状瘤中的阳性表达率(25/36,69.4%)较内翻生长型UC(28/38,73.7%)略低,其差异无统计学意义(P=-0.798)。2)Ki-67和CK20联合检测,在内翻性乳头状瘤中3/36(8.3%)病例有1个标记为阳性。在内翻生长型UC中13/38(34.2%)病例中2个标记均为阴性。3. FISH结果：3、7、17号染色体中至少2个染色体扩增或9p21纯合性缺失为UroVysion FISH阳性。内翻生长型UC中24/38(63.2%)病例阳性,内翻性乳头状瘤中均为阴性。Ki-67与CK20均为阴性的内翻生长型UC中有9/13(69.2%)UroVysion FISH阳性。Ki-67、CK20与UroVysion FISH三者联合检测(至少一个指标为阳性)敏感性89.5%,特异性97%。第二部分1.Ki-67和CyclinD1的表达及与病理分期、分级的关系1)浅表性UC中,Ki67高表达者占73/125(58.4%),其表达与肿瘤分级显著相关(P<0.001),高级别肿瘤中表达增高。肌肉浸润性UC中,Ki67高表达者占92/124(74.2%),与肿瘤分级显著相关(P<0.001),高级别UC中表达增高。Ki67表达在浅表性UC和浸润性UC中均与分期无明显相关性(P=1.000,P=0.443)。2)浅表性UC中,CyclinD1高表达者占69/124(55.6%),其表达与肿瘤分级显著相关(P<0.001),高级别UC中表达降低。肌肉浸润性UC中,CyclinD1高表达者占33/124(26.6%),其表达与肿瘤分级无显著相关性(P=0.3)。低级别肿瘤中,CyclinD1表达与分期显著相关(P=0.029),肌肉浸润性UC比浅表性UC CyclinD1表达低。高级别UC中,CyclinD1表达与分期无显著相关性(P=0.068)。3)Ki-67和CyclinD1表达的相关性：浅表性UC中,CyclinD1表达与Ki67表达呈负相关(P=0.003,相关系数=-0.265)。而肌肉浸润性UC中二者无明显相关性(P=0.485)。2.Ki-67和CyclinD1表达与预后的关系1)浅表性UC中,Ki-67表达与预后相关(P=0.02),高表达者无病生存(Disease-free Survival, DFS)时间短。CyclinD1与预后显著相关(P<0.001),低表达者无病生存时间短。2)肌肉浸润性UC中,Ki-67表达与预后无显著相关性(P=0.069), CyclinD1与预后也无显著相关性(P=0.441)。3.3、7、17号染色体及9p21异常与病理分期、分级的关系1)低级别UC中,发生3、7、17号染色体扩增及9p21纯合性缺失的病例分别占24/60(40%),14/60(23.3%),13/60(21.7%)及18/60(30%),均与病理分期(分为浅表性Ta-T1和肌肉浸润性T2-T4)无显著相关性(P=1.000,P=0.427,P=0.099,P=0.571)。2)高级别UC中,发生3、7、17号染色体扩增及9p21纯合性缺失的病例分别占99/119(83.2%),98/119(82.40／o),95/119(79.8%)及49/119(41.20%)。7号染色体扩增及9p21纯合性缺失与分期(分为浅表性和肌肉浸润性)相关(P=0.027,P=0.026),而3号染色体及17号染色体扩增均与肿瘤分期无显著相关性(P=0.322,P=0.108)。3)浅表性UC中,发生3、7、17号染色体扩增及9p21纯合性缺失的病例分别占60/101(59.4%),50/101(49.5%),50/101(49.5%),及31/101(30.7%).3、7.17号染色体扩增与肿瘤分级相关(P<0.001,P<0.001,P<0.001),而9p21纯合性缺失与肿瘤分级无显著相关性(P=0.831)。4)肌肉浸润性UC中,发生3、7、17号染色体扩增及9p21纯合性缺失的病例分别占63/78(80.8%),62/78(79.5%),58/78(74.4%)及36/78(46.2%)。3、7、17号染色体扩增与肿瘤分级相关(P=0.003,P<0.001,P<0.001),而9p21纯合性缺失与肿瘤分级不相关(P=0.097)。4.3、7、17号染色体及9p21异常与预后的关系(Kaplan-Meier法)1)浅表性UC中,7号染色体和17号染色体扩增与预后相关(P=0.043,P=0.016),扩增者无病生存时间短。3号染色体和9p21异常则与预后无显著相关性(P=0.610,P=0.241)。2)肌肉浸润性UC中,17号染色体扩增和9p21纯合性缺失与预后显著相关(P＝0.013,P=0.042)。17号染色体扩增者及9p21纯合性缺失者无病生存时间短。3号染色体和7号染色体扩增与预后无明显相关性(P=0.188,P=0.116)。5.无病生存的预测1)浅表性UC中,经单因素分析与无病生存相关的因素有分级、肿瘤数量、7号染色体扩增、17号染色体扩增、Ki-67和CyclinD1表达。经多因素分析,肿瘤数量和CyclinD1表达是无病生存的独立的预后因素(P=0.036,P=0.013)。肿瘤为多发性及CyclinD1低表达者预后差。2)肌肉浸润性UC中,经单因素分析与无病生存相关的因素有分级、分期、17号染色体扩增和9p21纯合性缺失。经多因素分析分期是肌肉浸润性UC无病生存的独立的预后因素(P=0.009)。T3-T4期患者比T2期预后差。1.形态学上细胞索或巢不规则,核分裂像常见,出现纤维血管轴心是内翻生长型UC的特征。2.免疫组化Ki-67和CK20可用于内翻性乳头状瘤与低级别非浸润性内翻生长型UC的鉴别诊断。3. UroVysion FISH在内翻性乳头状瘤与低级别非浸润性内翻生长型UC的诊断中有较高的敏感性和特异性。大部分Ki-67和CK20表达均为阴性的低级别非浸润性内翻生长型UC UroVysion FISH阳性。4.Ki-67在浅表性UC和肌肉浸润性UC中的高表达均与肿瘤高级别相关。5. CyclinD1在浅表性UC中的低表达与肿瘤高级别相关。低级别UC中,CyclinD1表达与分期显著相关,CyclinD1在肌肉浸润性UC比浅表性UC表达更低。6.浅表性UC中,CyclinD1表达与Ki67表达呈负相关。7.无论是浅表性UC还是肌肉浸润性UC,3、7、17号染色体扩增均与UC高级别相关。在高级别UC中7号染色体扩增及9p21纯合性缺失与病理分期相关,高分期肿瘤更容易出现异常。8.浅表性UC中,单因素生存分析显示分级、肿瘤数量、7号染色体、17号染色体、Ki-67和CyclinD1表达是影响无病生存的因素；多因素分析显示肿瘤数量和CyclinD1表达是无病生存的独立的预后因子。9.肌肉浸润性UC中,单因素生存分析显示分级、分期、17号染色体和9p21是影响无病生存的因素；多因素分析显示分期是独立的预后因素。