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植物油脂是人类膳食的主要成分,人类日常生活及饮食所需要的油脂有71%来源于植物油。植物油脂的主要用途和经济价值由它们的脂肪酸组成所决定。研究表明,合理的脂肪酸摄取量对人体的健康有重要的影响。尤其是摄入一定量的多不饱和脂肪酸(PUFA),对冠心病的治疗、大脑的发育和视觉能力的提高等都很有利。目前人们对多不饱和脂肪酸的合成途径已经有了比较清楚的了解。植物中主要的PUFA有:亚油酸、a-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)。其中亚油酸(C18.2△<9,12>,LA)是a-亚麻酸(C18:3△<9,12,15>,ALA)的前体,是人体自身不能合成需要从食物中摄取的必需脂肪酸之一,具有抗辐射、抗动脉硬化和降胆固醇等保健作用。而a-亚麻酸又是合成EPA和DHA的重要前体之一,具有增强视力、提高记忆力、降低血脂等生理功能。油酸经△<12>-脂肪酸脱氢酶催化形成亚油酸,亚油酸又可以经△<15>-脂肪酸脱氢酶催化形成a-亚麻酸,△<12>-脂肪酸脱氢酶和△<15>-脂肪酸脱氢酶是油酸形成亚油酸再形成a-亚麻酸过程中的两个限速酶。因此可以通过转基因的方法过量表达关键酶基因,从而使特定植物中的亚油酸或a-亚麻酸等必需脂肪酸的含量增加,目的是为人类提供对人体更为有益的食用油脂或医用药物。
油菜是我国重要的油料作物之一,目前对油菜基因工程的研究已经取得了很大的进展,油菜中多个脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列相继被克隆出来,这为我们进行油菜脂肪酸脱氢酶基因的研究奠定了良好的基础。本研究的主要工作和取得的成果如下:
1. 通过PCR方法从甘蓝型油菜基因组DNA中克隆出△<12>-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD2的cDNA序列,全长1155bp,编码384个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜.BnFAD2基因(AF243045)的核苷酸序列相似性为99%,所编码的氨基酸序列相似性为100%。
2. 通过PCR方法克隆出甘蓝型油菜中种子储藏蛋白的BnNapA基因的启动子BnNapAP。经序列分析,该序列具有多种种子特异性启动子序列元件。由此推测该启动子可以启动外源基因的种子特异性表达。
3. 通过RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆了△<15>-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD3的cDNA序列,全长11.52bp,编码383个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜BnFAD3基因(AY.599884)的核苷酸序列相似性为99%,所编码的氨基酸序列相似性为99%。
4. 将甘蓝型油菜的核基质结合区MAR序列插入到植物表达载体pZP212中GUS基因表达框两侧,分析了该序列在转基因烟草中的功能,即转基因烟草与没有插入MAR序列的对照相比,GUS蛋白活性的平均水平可以提高2倍,最高可达7倍,证明了甘蓝型油菜中的MAR序列可以提高报告基因GUS的表达水平。
5.构建了MpZPFAD2M和以BnNaAP为启动子的MpZPFAD3M高效表达载体并转化模式植物烟草,分别获得PCR阳性转基因植株15棵和14棵。