第一部分：人原发性肝癌耐奥沙利铂耐药细胞系的建立及鉴定　　目的：为研究人原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐奥沙利铂(oxaliplatin, oxl)耐药的机制，建立HepG2耐奥沙利铂耐药细胞系。　　方法：应用HepG2细胞系，通过浓度梯度诱导法即培养液中奥沙利铂浓度梯度增加法，长期筛选培养，得到肝癌耐奥沙利铂耐药细胞株HepG2/oxl。以 MTT法检测其增殖速度及HepG2/oxl的多药耐药性；用流式细胞术检测耐药亚系与亲本细胞的细胞周期分布和凋亡的变化及用奥沙利铂处理以后细胞周期及凋亡的变化；用Traswell小室检测耐药细胞株的侵袭能力。用半定量RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Survivin的基因表达水平；Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Survivin的蛋白表达水平。　　结果：1.成功建立13.0μg/ml奥沙利铂浓度下稳定生长的耐药细胞株。2.经MTT法检测，HepG2/oxl细胞与HepG2细胞相比，细胞生长速度变慢，对5-FU、DDP耐药性；其IC50值分别是其它两种药物的32.34和89.37倍，耐药指数分别是5.42和78.39倍。耐药亚系比亲本细胞有更强的侵袭力。3.奥沙利铂对细胞周期有明显的影响，耐药亚系细胞阻滞在S期，并且奥沙利铂作用后耐药亚系与亲本细胞相比细胞凋亡率减少。4.该耐药模型与亲本细胞相比 Bcl-2和 Survivin基因表达上调，Bax基因表达下调（P＜0.01）　　结论：HepG2/oxl细胞是一个明确的耐药模型，具有耐药细胞的基本特性及强的转移能力，S期是奥沙利铂使细胞凋亡的检测点；其多药耐药机制可能与细胞凋亡耐受有关。　　第二部分：人原发性肝癌耐奥沙利铂耐药细胞系生物学性状及多药耐药相关蛋白在耐药机制中作用的研究　　目的：化疗对晚期原发性肝细胞性肝癌无确定的生存期获益，这与HCC细胞对药物的抗拒有关。本研究拟在肝癌细胞系 HepG2上，考察奥沙利铂获得性耐药相关基因，探讨HCC的耐药机制。　　方法：以浓度递增法诱导HCC细胞系HepG2，建立不同耐药等级的Oxl耐药亚系，以MTT法检测耐药细胞株的耐药指数；以半定量 RT-PCR法测定多药耐药蛋白（Multi-Drug Resistance Protein, MDR1）、多药耐药相关蛋白(Multi-Drug Resistance Related Protein, MRP)和乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein, BCRP)在亲代和不同耐药亚系中的mRNA表达，并在蛋白水平以Western Blot法验证基因表达的差异性。　　结果：1）成功建立了 IC50值为15和25倍亲代细胞的oxl耐药亚系(HepG2/oxl)。2)在mRNA和蛋白水平，与亲本细胞相比BCRP的表达与HepG2的耐药性成正相关，随着耐药物浓度的增加BCRP得表达逐渐增加(p<0.05)；与亲本细胞相比MDR1、MRP在2.5μg/ml的奥沙利铂耐药亚系中表达高增高(p<0.05)，而在5.0μg/ml的奥沙利铂耐药亚系中表达降低(p<0.05)。结论：BCRP在HePG2对oxl获得性耐药中起着重要作用，MDR1和MRP在HePG2/oxl耐药过程中早期起着主要作用，但随着耐药浓度的增加作用越来越弱。　　第三部分：应用基因芯片筛选人原发性肝癌耐奥沙利铂耐药相关基因及其验证　　目的：应用基因芯片技术研究人原发性肝癌耐奥沙利铂耐药细胞株HepG2/oxl与其亲本细胞HepG2（敏感株）之间的基因表达谱差异，筛选耐药相关基因，探讨基因表达谱差异与肝癌耐药之间的相关性。　　方法：分别提取HepG2/oxl耐药细胞株与HepG2亲本细胞的总RNA并纯化mRNA；将等量的mRNA逆转录，以Cy5与Cy3标记的cDNA做探针，在Affymetrix公司的Human Genome U133 Plus2.0 Array(HG-U133 Plus2.0)这款芯片上进行杂交。扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。　　结果：在人肝癌耐奥沙利铂细胞和人肝癌细胞之间共筛选出显著表达差异基因376条，其中190种基因表达水平下调，186中基因表达上调，主要涉及细胞信号转导和传递蛋白，蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道和运输蛋白、代谢、发育等14大类相关基因。上调基因主要为MDM2、TP53INP1、GDF15，下调基因主要为RAB42、MAI1、NCRNA00153等。　　结论：（1）人原发性肝癌耐奥沙利铂细胞和人原发性肝癌细胞基因表达有明显差异。（2）这些差异表达基因，揭示了肝癌对奥沙利铂耐药机制是一个多基因、多因素参与的复杂生物过程。（3）筛选出的差异表达基因可能与肝癌对奥沙利铂耐药相关。