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目的:根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)来源于发育中的根尖牙乳头组织,具有优越的自我更新、多向分化及免疫调节性能。本课题组前期在体外构建SCAP与CD4+T细胞transwell共培养体系,发现SCAP可上调CD4+T细胞叉状头转录因子3(forkhead box protein-3,Foxp3)的表达水平,促使其向调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)转化。Tregs是一类CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞亚群,可通过抑制过激的免疫反应改善宿主局部免疫微环境,促进损伤组织的修复与再生。Foxp3是Tregs发育和成熟的关键转录因子。近来研究发现Tregs内Foxp3位点低甲基化状态是维持Foxp3稳定表达及Tregs获得完整免疫抑制表型的必要条件。因此,本课题拟探究SCAP在促进CD4+T细胞向Tregs转化过程中,对CD4+T细胞Foxp3位点甲基化水平,及DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)和去甲基化酶10-11易位蛋白(ten-eleven translocation,TET)家族蛋白表达水平的影响,以进一步明确SCAP对Tregs转化的免疫调节作用,为相关机制的深入研究奠定基础。研究方法:(1)采用酶消化法从根尖牙乳头提取原代SCAP并培养,检测SCAP干细胞表面标志物表达水平及SCAP成骨和成脂向分化性能。(2)提取小鼠脾脏T淋巴细胞,应用免疫磁珠分选CD4+T细胞,流式细胞术检测CD4+T细胞纯度。(3)应用transwell将SCAP与CD4~+T细胞以1:5的比例在体外共培养72 h(共培养组),以单独培养的CD4+T细胞为对照组,流式细胞术检测各组CD4+T细胞增殖水平及Tregs转化比例。(4)应用目的区域富集甲基化测序(Methyl Target?)技术检测CD4+T细胞Foxp3位点甲基化水平;DNA羟甲基化免疫沉淀-聚合酶链反应技术检测Foxp3位点5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)表达水平。(5)Real time-PCR检测CD4~+T细胞内甲基转移酶DNMT1、去甲基化酶Tet1、Tet2及Tet3的mRNA表达水平;Western blot检测CD4~+T细胞内DNMT1、Tet1及Tet2的蛋白表达水平。实验结果采用SPSS20.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:(1)原代培养的SCAP贴壁生长,呈梭状;SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物CD105、CD90、CD44、CD29,不表达造血干细胞表面标记物CD45、CD34;经成骨向诱导后,茜素红S染色可见SCAP形成矿化结节;经成脂向诱导后,油红O染色可见脂滴形成。因此,本研究中SCAP符合国际干细胞研究协会制定的干细胞鉴定标准。(2)免疫磁珠分选后CD4+T细胞纯度达97.27±2.30(%)。(3)共培养组(SCAP+CD4+T细胞)与对照组(CD4+T细胞)的CD4+T细胞增殖率无显著差异(P>0.05);与对照组相比,共培养组中CD4+T细胞的Foxp3表达水平上升,Tregs转化比例提高(P<0.05)。(4)与对照组相比,共培养组中CD4+T细胞Foxp3位点甲基化程度下降;Foxp3位点5hmC表达水平升高(P<0.05)。(5)与对照组相比,共培养组中CD4+T细胞内甲基转移酶DNMT1表达水平降低,去甲基化酶Tet2表达水平提高(P<0.05),而Tet1及Tet3无明显变化(P>0.05)。结论:SCAP可通过旁分泌作用下调CD4+T细胞Foxp3位点甲基化程度,从而维持Foxp3稳定表达。SCAP诱导Foxp3位点去甲基化可能与抑制甲基转移酶DNMT1的表达,增强去甲基化酶Tet2的表达有关。