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第一部分LXR活化后对胰岛素抵抗下肝糖代谢的影响研究目的:观察胰岛素抵抗下LXR活化后对糖代谢的改善作用和对成脂的影响。材料和方法:(1)选用雄性db/db和C57BL/6小鼠作为研究对象,随机分为db/db对照组(db/dbCon)和db/dbTO901317组(db/dbTO);C57Con组和C57TO组。每组入组9只。db/db和C57Con组每日腹腔注射DMSO(10%DMSO250ul),db/db和C57TO组每日腹腔注射LXR激动剂TO901317(30mg/Kg),一共用药14天。小鼠用药前测定体重、空腹血糖和腹腔胰岛素耐量试验,用药后测定体重、空腹血糖、空腹胰岛素和游离脂肪酸(Freefattyacid,FFA)及行腹腔胰岛素耐量试验。小鼠处死后选取肝脏作为研究器官,肝脏组织学检查观察肝细胞脂肪变性情况。实时定量-聚合酶链反应(Real-TimePCR)的方法测定各组小鼠肝内磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-pase)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)mRNA的表达改变情况。(2)选取HepG2细胞,应用棕榈酸(Palmitate,PA)诱导,通过免疫印迹法评估蛋白激酶B(Akt)蛋白磷酸化水平的变化,建立胰岛素抵抗的细胞模型。应用Real-TimePCR的方法观察TO901317对细胞内PEPCK、G-6-pase和SREBP-1cmRNA的表达变化。结果:(1)与C57小鼠比较,db/db小鼠具有体重、血糖、胰岛素、FFA和HOMA-IR显著增高的特性,P<0.05。与db/dbCon组相比,db/dbTO组的血糖下降,空腹胰岛素水平降低,胰岛素敏感性显著改善,P<0.05,血清游离脂肪酸没有改变。与C57Con组相比,C57TO组体重、血糖、胰岛素、FFA和HOMA-IR无明显改变。肝脏组织学结果显示,与C57小鼠相比,db/db小鼠具有明显的肝脏脂肪浸润病理改变,在应用TO901317后,病变略有加重。C57小鼠用药后肝脏组织学检查无明显变化。Real-Time结果显示,与db/dbCon组相比,db/dbTO组小鼠PEPCK和G-6-pasemRNA表达量显著下调,P<0.05,而C57TO与C57Con组相比,PEPCK和G-6-pasemRNA表达无明显改变。与db/dbCon和C57Con组相比,db/dbTO和C57TO组小鼠SREBP-1cmRNA表达均显著上调。(2)HepG2诱导成模后,出现Akt蛋白磷酸化水平降低,PEPCK和G-6-pasemRNA表达上调,P<0.05。TO901317单独应用对HepG2内PEPCK和G-6-pasemRNA表达无调节效应,但SREBP-1cmRNA表达显著上调,P<0.05。TO901317与PA共同孵育HepG2细胞后,逆转了PA单独孵育HepG2所致的PEPCK和G-6-pasemRNA的表达上调,P<0.05。结论:在胰岛素抵抗下LXR活化后具有显著的降糖和增加胰岛素敏感性的效应,并有轻微的促成脂作用。在无胰岛素抵抗状态下,LXR活化后对糖代谢无调节作用,促成脂作用仍然存在。LXR的降糖效应可能与PEPCK和G-6-pasemRNA表达下调相关。第二部分LXR活化后改善肝胰岛素抵抗的分子机制研究目的:探讨胰岛素抵抗状态下LXR活化后通过抗氧化应激,抑制c-jun氨基末端激酶蛋白(JNK)信号通路的激活,从而改善胰岛素信号转导的分子机制。材料和方法:(1)应用免疫印迹法观察TO901317活化LXR后,db/db小鼠和C57小鼠肝内Akt蛋白磷酸化水平的改变及PA孵育下HepG2细胞内Akt蛋白磷酸化水平的改变。(2)用DHE法测定db/db和C57小鼠基线状态下肝细胞内活性氧簇(ROS)的水平。应用DCFH法测定单独应用PA孵育HepG2后,细胞内ROS的产量。(3)测定LXR活化后各组小鼠(分组同第一部分)肝内ROS产量的变化。测定联合应用PA和TO901317孵育HepG2后,细胞内ROS产量的变化。(4)应用免疫印迹法观察LXR活化后各组小鼠肝脏JNK蛋白磷酸化水平的改变及HepG2在PA与TO901317共同孵育下细胞内的JNK蛋白磷酸化水平的改变。结果:(1)Western结果显示,与db/dbCon组比较,db/dbTO组小鼠肝脏Akt蛋白的磷酸化水平降低,Akt总蛋白水平不变。与C57Con组比较,C57TO组小鼠肝脏Akt蛋白的磷酸化水平和Akt总蛋白水平均未出现改变。在棕榈酸孵育下,HepG2细胞的Akt蛋白磷酸化水平降低,Akt总蛋白水平不变。(2)基线状态下db/db较C57小鼠肝组织内ROS量显著增多。LXR活化后,db/dbTO组小鼠较db/dbCon组肝脏ROS生成显著减少。C57TO组小鼠和C57Con组相比,肝脏ROS水平没有明显改变。(3)PA可促进HepG2中ROS生成。与PA单独孵育HepG2比较,PA与TO901317共同孵育后HepG2细胞内ROS产量减少。(4)Western结果显示,与db/dbCon组比较,db/dbTO组小鼠肝脏JNK蛋白磷酸化水平降低,JNK总蛋白水平不变。与C57Con组比较,C57TO组小鼠肝脏的JNK磷酸化水平和JNK总蛋白未出现改变。与PA单独孵育HepG2相比,PA与TO901317共同孵育后HepG2细胞内JNK磷酸化水平降低,JNK总蛋白不变。结论:LXR活化后能够通过减少游离脂肪酸诱导的ROS生成,抑制JNK应激信号通路的活化,最终恢复Akt的磷酸化,改善胰岛素抵抗。第三部分LXR活化后对氧化应激反应的调节研究目的:探索LXR信号通路抗氧化应激的分子机制。材料和方法:(1)分别应用TO901317和N-乙酰半胱氨酸(NAC)孵育HepG2,应用DCFH法测定细胞内ROS产量的变化。(2)TO901317和NAC分别与PA联合孵育HepG2后,测定细胞内ROS产量的变化。(3)应用Westernblot方法评估经NAC预处理后,PA孵育HepG2,细胞内Akt磷酸化水平和总Akt蛋白量。(4)应用Real-TimePCR的方法测定LXR活化后,db/db小鼠肝细胞和PA和TO901317共同孵育下的HepG2细胞内氧化还原反应相关基因的表达变化情况。结果:(1)单独应用TO901317和单独应用抗氧化剂NAC孵育细胞,均能显著降低ROS生成,P<0.05。(2)TO901317和NAC均能减少PA引发的ROS过度生成。(3)Western结果显示,NAC预处理后增加了HepG2细胞内因PA降低的Akt蛋白磷酸化水平。(4)Real-Time结果显示,与Con组相比,db/dbTO组小鼠肝脏中NF-E2相关因子2(NF-E2relatedfactor2,Nrf2)和超氧化物歧化酶Mn-SODmRNA的表达显著增高;HepG2中也发现Nrf2和Mn-SODmRNA表达增加。结论:LXR的专属激动剂TO901317可能是一种未被发现的还原剂,LXR信号通路可能是通过上调抗氧化因子Nrf2和Mn-SODmRNA的表达,抑制ROS生成,从而调控氧化应激反应,最终产生降糖和改善胰岛素敏感性的作用。