背景前列腺癌是全球第二常见的癌症,也是导致男性癌症相关死亡的第五大原因。用血清前列腺特异性抗原(PSA)筛查前列腺癌的目的是在早期、可干预的阶段发现前列腺癌,以便进行治疗并降低总体死亡率和疾病特异性死亡率。但是最近的回顾性研究发现PSA筛查导致前列腺癌诊断的增加,但并没有降低总体死亡率及疾病特异性死亡率。相反,筛查可能增加过度诊断和治疗带来的并发症的风险。PSA检测的假阳性率高,而且不能预测预后。因此需要额外的生物标志物辅助前列腺癌的诊断、治疗及预测预后。细胞毒性淋巴细胞是免疫监测的关键角色,这些淋巴细胞包括自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞,它们通过激活性受体(NKG2D),被配体(NKG2DLs)激活后,参与各种应激应反应。因此,NKG2D-NKG2DLs相互作用是调节先天和适应性免疫反应的关键。当配体识别后,含有NKG2D的NK和T细胞被激活,触发靶细胞裂解。受体与其配体的结合也会触发细胞因子和趋化因子的产生,从而调节免疫反应,帮助维持组织的稳态。MICA和MICB是NKG2D识别的应激诱导分子,与NKG2D结合后,免疫效应细胞的NKG2D介导的溶细胞免疫反应将被激活,对抗病毒感染和表达MICA的肿瘤细胞。在早期肿瘤发生发展过程中,膜结合MICA是招募抗肿瘤免疫效应分子的关键信号。晚期肿瘤通过膜结合MICA分子的蛋白水解,下调细胞表面MICA的表达,释放出可溶性MICA(sMICA),从而有利于肿瘤的增殖。MICA的多态特征及其在肿瘤进化过程中的表达失调导致了各种癌症类型的肿瘤逃避。因此,了解MICA相关肿瘤逃逸机制以及MICA的分子/细胞调控对肿瘤的诊断、治疗以及重建肿瘤免疫监测具有重要意义。第一部分血清可溶性MICA(sMICA)水平对前列腺癌患者预后的价值目的通过评价不同分期前列腺癌患者血清可溶性MICA(sMICA)水平、PSA水平、PS评分、EOD评分、肿瘤病理,明确前列腺癌患者预后的影响因素。方法检测136例前列腺癌患者血清sMICA水平,其中B期36例,C期20例,D期80例。使用单因素和多因素Cox回归模型分析评估肿瘤组织学、体力状况评分(PS)、骨转移、血清前列腺特异性抗原(PSA)水平和sMICA水平对疾病特异性存活的预后意义。结果1.B、C 和 D 期前列腺癌患者 sMICA水平是 198.4±7.2 pg/ml、229.8±8.3 pg/ml和578.4±12.2 pg/ml。B期与C期血清sMICA水平差异无统计学意义(P>0.05),B期与D期、C期与D期血清sMICA水平差异有统计学意义(P<0.05)。2.B、C和D期前列腺癌患者的血清PSA水平分别是63.3±13.7 ng/ml,178.1±14.6 ng/ml 和 303.8±157.1 ng/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。sMICA与 PSA 显著相关 r=0.76,P<0.05)。3.sMICA在前列腺癌中具有辅助诊断价值(AUC=0.92),最佳截断值为283pg/ml,其约登指数为0.688,对应的敏感性为85.3%,特异性为83.3%。4.单因素分析显示患者 EOD≥1、sMICA≥283 pg/ml、PS≥1 和 PSA>100 ng/ml的生存时间明显低于他们各对应项(P<0.05),肿瘤组织学与预后无显著相关性。多因素Cox回归分析结果表明,sMICA和EOD是影响前列腺癌患者生存时间的重要因素。结论1.远处转移前列腺癌(D期)患者血清sMICA水平明显高于局部浸润前列腺癌(C期)和局限性前列腺癌(B期)患者。2.前列腺癌患者血清sMICA水平与PSA水平呈正相关。3.sMICA在前列腺癌中具有辅助诊断价值。4.sMICA和EOD为影响前列腺癌患者生存时间的重要因素。第二部分前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA表达的相关性目的通过检测前列腺癌患者外周血NK细胞表面活化受体NKG2D及其配体MICA的可溶形式(sMICA)的表达水平,探讨前列腺癌患者NK细胞活化受体NKG2D及其配体MICA的表达的相关性及NKG2D-sMICA与前列腺癌免疫逃逸的关系及临床意义。方法ELISA和流式细胞术分别检测60例前列腺癌患者治疗前后和20例健康志愿者血清中可溶性MICA(sMICA)水平和外周血中NK细胞受体NKG2D的表达。结果1.sMICA表达水平前列腺癌组、正常组血清sMICA浓度分别为290.1±86.1 pg/ml、109.9±15.5 pg/ml,差别有统计学意义。前列腺癌患者中,B期22例、C期17例、D期21例,血清 sMICA 浓度分别为 199.8±14.9 pg/ml、283.8±26.7 pg/ml、389.8±40.6 pg/ml,D期明显高于B期、C期,差别有统计学意义(P<0.05)。2.NKG2D表达水平前列腺癌组、正常组NKG2D表达水平分别为78.9±3.8%、90.4±4.0%,差别有统计学意义。前列腺癌患者中B、C、D期NKG2D表达分别为81.0±4.8%、76.3±4.0%、67.0±4.0%,差别有统计学意义(P<0.05)。3.前列腺癌患者NKG2D与sMICA的相关性Spearman相关系数为-0.896,呈负相关,具有统计学意义(P<0.05)。4.治疗后sMICA和NKGD根治性前列腺切除术或雄激素剥夺治疗后3个月,前列腺癌患者中,B期17 例、C 期 22 例、D 期 21 例,血清 sMICA 浓度分别为 138.2±15.4 pg/ml、215.9±18.7 pg/ml、304.8.6±35.2 pg/ml,与治疗前比较明显降低,差别有统计学意义。术后前列腺癌患者中B、C、D期NKG2D表达分别为88.2±4.9%、81.8±4.0%、77.2±4.7%,各组与治疗前比较明显升高,差别有统计学意义(P<0.05)。结论1.前列腺癌患者NK细胞表面活化性受体NKG2D表达会降低,进而导致NK细胞杀伤肿瘤的活性下降,这可能是引起前列腺癌免疫逃逸的重要机制。2.随着前列腺癌的进展,MICA从前列腺癌表面脱落形成sMICA,血清中sMICA含量增高,而NK细胞受体NKG2D表达下调。前列腺癌患者血清sMICA水平与外周血NK细胞活化性受体NKG2D表达呈负相关。sMICA的异常增高可能是NKG2D表达下降的重要原因。3.根治性前列腺切除术、雄激素剥夺治疗可降低患者血清sMICA水平,同时提高NK细胞受体NKG2D的表达。第三部分重组sMICA蛋白及吉西他滨对NK细胞功能的影响目的研究重组人sMICA和化疗药物吉西他滨在体外对NK细胞活化性受体NKG2D及其分泌IFN-γ的影响。方法使用密度梯度离心法,分离健康成年男性外周血单个核细胞,然后使用免疫磁珠法分选NK细胞。将培养的NK细胞分为空白对照组及sMICA组、GEM组。空白对照组加等体积的完全培养基,sMICA组分别加不同浓度重组sMICA250 pg/ml、500 pg/ml、1000 pg/ml,GEM 组分别加入重组 sMICA250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml和吉西他滨5 mg/L,加入NK细胞,孵育过夜,收集NK细胞,使用流式细胞仪检测其NKG2D受体表达水平,然后收集培养液上清,用ELISA法检测其IFN-y的分泌水平。结果1.NKG2D表达水平sMICA1 组、sMICA2 组、sMICA3 组 NKG2D 表达率分别为 74.1±5.4%、57.83±3.9%、41.1±5.4%,实验组NKG2D表达率均明显低于空白对照组(90.6±4.0%),差异有统计学意义(P<0.05)。sMICA3 组、sMICA2 组、sMICA3组NK细胞NKG2D受体的表达率逐渐降低,且不同浓度组间比较,差异有统计学意义(PO.05)。GEM1组、GEM2组、GEM3组NKG2D表达率分别为85.5±2.9%、66.3±5.0%、51.8±5.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。sMICA1-GEM1、sMICA2-GEM2、sMICA3-GEM3组NKG2D表达水平(%)两两比较,差别均有统计学意义(P<0.05)。2.培养液上清中IFN-γ分泌水平sMICA1 组、sMICA2 组、sMICA3 组 IFN-γ浓度分别为 190.5±12.4 pg/ml、100.4±10.5 pg/ml、61±6.4 pg/ml,均明显低于空白对照 307.3±16.6 pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。sMICA3 组、sMICA2 组、sMICA3 组 NK 细胞 IFN-γ的分泌水平逐渐下降,各浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。GEM1组、GEM2 组、GEM3 组 IFN-y浓度分别为 216.3±18.8 pg/ml、161.8±11.1 pg/ml、93.3±18.5 pg/ml,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。sMICA1-GEM1、sMICA2-GEM2、sMICA3-GEM3组IFN-γ浓度之间比较,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论1.重组可溶性MICA(sMICA)在体外可以下调NK细胞表面受体NKG2D的表达;2.重组可溶性MICA(sMICA)在体外可以降低IFN-γ的分泌水平;3.吉西他滨除具有免疫调节作用,可以通过上调NK细胞活化性受体NKG2D的表达,改善NK细胞的功能。NK细胞联合吉西他滨治疗晚期肿瘤值得深入研究。