大肠癌为胃肠道常见的恶性肿瘤,仅次于胃癌、食管癌。大肠癌在不同地区,发病率具有明显差异。据世界肿瘤流行病学调查统计,大肠癌在西欧、北美、澳大利亚等地的发病率最高。在世界范围内我国属于低发区。近年来世界上大肠癌有上升趋势(发病率正以2%的速度上升),我国随着经济的进步,生活方式和饮食结构的变化大肠癌递增速度是世界平均水平的两倍,达到年均增加4%。目前,治疗方法仍以手术切除为主,化、放疗为辅,并在短期内取得较好的效果,但其副作用、对机体的伤害性及高复发率也不容忽视,尤其对已发生局部或远处转移者很难达到理想的远期疗效。因此,探寻大肠上皮细胞癌变、演化、和转移机制,早期发现大肠癌或干预进展期大肠癌的侵袭和远处转移,延长大肠癌患者的5年生存率,对于大肠癌的治疗具有重要意义。近年来,在分子生物学领域,对肿瘤相关生存信号通路的研究越来越深,能正确认识参与大肠癌侵袭转移的各种信号通路的调节作用,研究一种新的抑制大肠癌发生发展、侵袭转移的治疗方法将成为新的热点,必会给大肠癌的治疗带来突破性的进展。P13K(磷脂酰肌醇-3激酶)是已发现的一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶。哺乳动物的P13K家族主要有3型同工酶。其中研究最广泛的是能被细胞表面受体所激活的Ⅰ型PI3K,ⅠA型PI3K是由催化亚单位p110α/β/δ/γ和调节亚单位p85α/β/γ所组成的异二聚体蛋白,具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的双重活性。PI3K通过两种方式激活,一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用,引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。PI3K激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3, PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1 (phosphoinositide dependentkinase-1)结合,使Akt转位于细胞膜并获得催化活性,催化自身的Ser124和Thr450磷酸化,PDK1能催化Akt蛋白的Thr308磷酸化,Akt还可能通过PDK2(如整合素连接激酶ILK)对其Ser473的磷酸化导致Akt的完全活化。IA型PI3K/Akt通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、粘附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。肿瘤的转移是一个复杂的过程,首先,肿瘤细胞通过细胞间粘附分子的改变获得离开原发病灶的潜能；其次,肿瘤细胞移动能力增强,降解细胞外基质,离开原发病灶进入新环境中生存。PI3K/Akt通路中的Akt1能调节细胞的移动能力,肿瘤中Aktl的过表达调节能增强肿瘤细胞的转移能力。AKT1的过表达与基质金属蛋白酶的活性增强有关。基质金属蛋白酶可激活与基质金属蛋白酶促进因子结合的核内κB因子,从而增强肿瘤细胞的血管生成,有利于肿瘤的生存。研究发现,其余的ATK亚型通过p1整合素及其他通路促进肿瘤的侵袭。因此,PI3K/AKT通路在肿瘤的转移中发挥重要的作用。PI3K作为PI3K/AKT通路的核心组成部分,以其为靶点,相对于AKT、mTOR等通路下级蛋白分子,能更全面地抑制下游通路的信号转导。LY294002和wartmannin为PI3K p110催化亚单位的特异性抑制剂,因能特异性抑制PI3K p110的活性,从而抑制下游蛋白AKT、mTOR激活及因此引起的下游信号分子的级联反应；其次,LY294002和wartmannin还能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而增强化疗药的效果,这些特点都为科学实验研究提供了有效的手段,但因为此类药可溶性差、细胞毒性高、最重要的是它为广泛抑制PI3K p110催化亚单位药物(PI3K/AKT通路不但参与肿瘤的发生、发展,它还参与正常细胞的分化、)严重影响了正常细胞的功能,从而阻碍了该药的临床应用。基于以上原因,需找一个特异性强、对正常细胞功能毒性小的蛋白为靶点,进行抑制肿瘤发生发展、侵袭转移的基因治疗必然是将来抗肿瘤治疗的发展趋势。本研究系统地检测PI3K p110β在大肠粘膜正常组织-大肠增生性息肉-大肠腺瘤-原发性大肠癌组织中的表达差异和分布特点,用RNAi方法将PI3K p110β基因沉默,再以结直肠癌细胞株SW480为研究对象观察PI3Kp110β基因沉默后结直肠癌SW480细胞PI3K/AKT通路中关键蛋白的表达水平变化及对结肠癌SW480细胞侵袭转移能力的影响,为今后大肠癌的基因治疗提供理论依据。材料与方法一、PI3K p110β在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义用免疫组织化学法检测PI3K p110β在大肠粘膜正常组织、大肠增生性息肉、大肠腺瘤以及原发性大肠癌组织中的表达情况,并分析PI3K p110β表达与大肠癌临床病理特征的关系。二、PI3K p110β表达缺失对大肠癌细胞侵袭和转移的影响1、PI3K p110βsiRNA序列参考相关文献的基因序列,并交由上海吉玛制药有限公司完成。2、细胞转染实验参照Invitrogen公司的Lipofectamine 2000TM产品说明书进行,转染后收集细胞提取细胞蛋白。3、PI3K p110βsiRNA转染SW480细胞后Western-Blot检测转染后PI3K 110β蛋白表达水平的改变。4、Western-Blot检测siRNA转染后SW480细胞p-Akt,Akt蛋白表达水平的变化,分析大肠癌细胞发生侵袭转移的可能通路。5、细胞划痕实验及Transwell实验检测siRNA转染后大肠癌SW480细胞转移侵袭能力的变化。三、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件得到。免疫组化结果采用秩和检验(Kruskal-Wallis test),其中PI3K p110β表达水平与大肠组织类型及大肠癌Dukes分期之间的相关性采用Spearman相关系数分析。其它数据两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),以均数±标准差(mean±SD)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、PI3Kp110β在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义免疫组化结果显示PI3K p110β表达主要定位于大肠病变组织上皮细胞的细胞浆,胞核中不表达。在大肠正常黏膜、大肠增生性息肉、大肠腺瘤和大肠癌组织中的p110p蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05)。大肠癌中高中低分化各组的PI3Kp110β蛋白表达阳性趋势的差异无统计学意义(P>0.05),但是在不同Dukes分期的大肠癌中PI3Kp110β蛋白表达阳性趋势的增加,差异具有统计学意义(P<0.05), Dukes B和Dukes C期的表达水平高于Dukes A期,伴远处转移的Dukes D期大肠癌PI3Kp110β蛋白表达水平最高。二、下调PI3K p110β表达对大肠癌细胞侵袭和转移的影响siRNA瞬时转染干扰SW480细胞PI3K p110β的表达,并分别命名为为设立目的基因干扰组(SW480siRNAp110β)、阴性对照(SW480contro1组)：表达与目的基因序列无同源性的siRNA片断和转染试剂对照组(SW480blank)1、Western-Blot法从蛋白水平检测SW480siRNA p110β组抑制效应与对照组(SW480control)及空白对照组(SW480blank)相比SW480 siRNAp110β蛋白水平差异具有统计学意义(P<0.05),表明抑制效果有差异,可选取该细胞株进行后续实验。2、通过Western-Blot检测PI3K下游参与细胞侵袭转移有关的关键通路蛋白Akt,p-Akt的表达量降低,差异具有统计学意义(p<0.05),表明下调PI3K p110β蛋白表达可明降低PI3K/Akt通路中有活性的Akt蛋白的表达。3、单层细胞划痕愈合实验单层细胞划痕24 h后,与SW480contro1组和SW480blank组比较,SW480 siRNAp110β组细胞迁移数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),同样,细胞侵袭试验SW480siRNAp110β组细胞迁移数少于SW480control组和SW480blank组细胞迁移数,差异有统计学意义(P<0.05),而SW480control组和SW480blank组间差异无统计学意义(P>0.05),表明下调PI3K p110β可抑制SW480细胞侵袭移动能力。结论1、免疫组织化学检测结果显示PI3K p110β表达从大肠正常粘膜-大肠息肉-大肠腺瘤-大肠癌依次递增,提示PI3K p110β在大肠癌的发生发展中具有重要作用。2、细胞侵袭迁移实验显示抑制PI3K p110β表达可抑制大肠癌细胞的侵袭转移能力。3、抑制PI3K p110β表达可有效降低有活性的Akt活性,从而抑制下游与大肠癌侵袭转移相关的蛋白、分子的活性,表明大肠癌的侵袭转移能力的增强与PI3K/Akt通路的活性异常相关。