目的:1.探索血塞通注射液及NEP1-40对SD大鼠脑梗死后不同时点(7天、14天和28天)及SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤后NgRl/RhoA/ROCKⅡ信号通路的调节作用。2.探索血塞通注射液及NEP1-40对SD大鼠脑梗死后7天梗死侧大脑皮层及血清中促炎因子IL-1β、TNF-α及抑炎因子IL-10、TGF-β1表达的影响。方法：1.首先建立局灶性脑梗死大鼠模型,采用SPF级雄性SD大鼠,应用改良的线栓法大鼠大脑中动脉栓塞术(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模拟永久性大鼠局灶性脑梗死模型,熟练手术操作以提高手术成功率,TTC染色评价MCAO手术模型脑梗死的效果。2.(1)大鼠脑梗死模型成功建立后进行正式实验。SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、血塞通组、NEP1-40组及血塞通+NEP1-40组,除假手术组外,其余4组动物均进行线栓法大脑中动脉栓塞术(MCAO),每组动物6只。术后各组动物给予不同药物干预治疗,每天进行体质量及神经功能评分观察并记录。脑梗死术后7天、14天及28天,分别进行样品取材,应用免疫组化及Western blot方法检测梗死侧皮层NgR1、RhoA和ROCKⅡ蛋白的表达量。(2)建立SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤模型(oxygen-glucose deprivati on/reoxygenation, OGD/R),应用CCK8法摸索血塞通注射液及NEP140作用于SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤后的最佳药物浓度。随后,SH-SY5Y细胞分为正常培养组、模型组、血塞通组、NEP1-40组及血塞通+NEP1-40组,除正常培养组外,其余4组进行OGD/R损伤。采用CCK8法检测各组缺糖缺氧损伤后的细胞存活率；采用Western blot及实时荧光PCR法(qRT-PCR)检测SH-SY5Y细胞NgR1、RhoA和ROCKⅡ蛋白及mRNA的表达量。3.SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、血塞通组、尼莫地平组、NEP1-40组和血塞通+NEP1-40组,除假手术组外,其余5组动物均进行线栓法大脑中动脉栓塞术(MCAO),每组动物6只。术后各组进行不同药物干预治疗,MCAO术后7天进行样品取材：麻醉后腹主动脉取血,迅速断头剥脑。采用ELISA法检测血清IL-1β、TNF-α及IL-10TGF-β1的表达量；采用免疫组化、Western blot法检测梗死侧皮层IL-1β, TNF-α及IL-10、TGF-β1蛋白的表达量；采用实时荧光PCR法(qRT-PCR)检测梗死侧皮层IL-1β、 TNF-α及IL-10、TGF-β1mRNA的表达量。结果：1.TTC染色显示大鼠梗死侧大脑呈现连续的白色梗死区域,而对侧未损伤区呈鲜红色,说明采用改良的线栓法大脑中动脉栓塞术(MCAO)成功建立了大鼠脑梗死模型。同时,本课题组成员熟练掌握了MCAO手术,提高了脑梗死大鼠造模成功率。2.SD大鼠假手术组术后体质量随着时间的延长不断增长。模型组体质量在MCAO术后7天、14天及28天,体质量与假手术组相比,均明显降低(P<0.01);血塞通、NEP1-40及联合用药组,体质量在MCAO术后7天及14天增长缓慢,与模型组比较均明显升高(P<0.01或P<0.05)；模型组及各治疗组在MCAO术后28天,体质量增长明显,各治疗组在MCAO术后28天体质量与模型组比较均明显升高(P<0.01)。SD大鼠假手术组无神经功能缺损表现。MCAO术后7天,模型组神经缺损评分(neurological deficit score, NDS)与假手术组比,显著升高(P<0.01),血塞通、NEP1-40及联合用药组经过7天治疗后,NDS评分与模型组比较,显著降低(P<0.01或P<0.05)。MCAO术后14天及28天,模型组NDS评分与假手术比显著升高(P<0.01),与术后7天比NDS评分明显下降；血塞通、NEP1-40及联合用药组与模型组相比,NDS评分下降,差异无统计学意义(P>0.05)。3.SD大鼠脑梗死7天后,与假手术组比,模型组梗死侧皮层NgR1、RhoA和ROCK II蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比相比,NEP1-40组明显降低皮层NgR1、RhoA蛋白的表达(P<0.01),对ROCK II蛋白具有降低作用,但差异无统计学意义(P>0.05)。血塞通组明显降低皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)。血塞通+NEP1-40组明显降低皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)。4.SD大鼠脑梗死14天后,与假手术组比,模型组梗死侧皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比相比,NEP1-40组明显降低皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)；血塞通组明显降低皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)；血塞通+NEP1-40组明显降低皮层NgR1、 ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05),能明显减低RhoA蛋白的表达量(WB；P<0.01),但免疫组化结果无统计学意义。5.SD大鼠脑梗死28天后,与假手术组比,模型组梗死侧皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白表达明显升高(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比,NEP1-40组明显降低皮层NgR1、 RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)：血塞通组明显降低皮层NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)；血塞通+NEP1-40组明显降低皮层NgR1、 RhoA和ROCK Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01或P<0.05)。6.细胞实验部分,NEP1-40作用于缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞的最佳浓度为10ng/mL,血塞通注射液作用于缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞的最佳浓度为320 mg/mL。7. SH-SY5Y细胞缺糖缺氧损伤后,模型组与正常培养组相比较,细胞存活率显著下降(P<0.01)：与模型组比较,NEP1-40、血塞通及血塞通+NEP1-40组其细胞存活率明显升高(P<0.01)。与正常培养组相比,模型组NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白及mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比较,NEP1-40组NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.01或P<0.05)；血塞通组NgR1、RhoA和ROCK Ⅱ蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.01或P<0.05)；血塞通+NEP1-40组NgR1、RhoA和ROCKⅡ蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.01或P<0.05)。8.SD大鼠脑梗死7天后,与假手术组相比,模型组血清IL-1β表达稍增高,但无统计学意义(P>0.05),血清TNF-α表达显著升高(P<0.01),血清IL-10表达明显降低(P<0.05),而血清TGF-β1表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较,血塞通能降低血清IL-1β、TNF-α的表达,但无统计学意义(P>0.05)；血塞通能明显升高血清IL-10的表达(P<0.05),同时升高血清TGF-β1的表达,但无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,尼莫地平能明显降低血清TNF-α的表达(P<0.05),同时降低血清IL-1β的表达,促进血清IL-10、TGF-β1表达升高,但均无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,NEP1-40组血清IL-1β、TNF-α表达降低,而血清IL-10、TGF-β1的表达增高,但均无统计学差异(P>0.05)。与模型组比较,血塞通+NEP1-40组能明显降低血清IL-1β、TNF-α的表达(P<0.05),明显促进血清IL-10的表达(P<0.05),能促进血清TGF-β1的表达,但无统计学意义(P>0.05)。9.SD大鼠脑梗死7天后,与假手术组相比,模型组梗死侧皮层促炎因子IL-1β、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.01或P<0.05),梗死侧皮层抑炎因子IL-10蛋白表达明显降低(P<0.01或P<0.05),而另一抑炎因子TGF-β1蛋白表达明显升高(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比,血塞通能明显降低IL-1β、TNF-α蛋白的表达(P<0.01),促进IL-10蛋白的表达(P<0.05),但对TGF-β1表达无明显改变(／>0.05)；尼莫地平能明显降低IL-1β TNF-α蛋白的表达(P<0.01),但对IL-10、TGF-1β蛋白的改变无明显差异(P>0.05); NEP1-40组明显降低IL-1β、TNF-α蛋白的表达(P<0.01或P<0.05),促进IL-10蛋白的表达(P<0.05),同时促进TGF-β1的表达,但无统计学差异(P>0.05)；血塞通+NEP1-40组明显降低IL-1β、NF-α蛋白的表达(P<0.01或P<0.05),促进IL-10蛋白的表达(P<0.05),同时促进TGF-β1的表达,但无统计学差异(P>0.05)。10.SD大鼠脑梗死7天后,与假手术组相比,模型组梗死侧皮层促炎因子IL-1β、TNF-α mRNA表达显著升高(P<0.01),梗死侧皮层抑炎因子IL-10mRNA表达明显降低(P<0.05),另一个抑炎因子TGF-β1 mRNA表达成倍数增长(P<0.01)。与模型组相比,血塞通能显著降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.01),促进IL-10 mRNA的表达(P<0.01),同时促进TGF-β1 mRNA表达的升高,但差异无统计学意义(P>0.05)；尼莫地平能显著降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.01),抑制IL-10 mRNA的表达、促进TGF-β1 mRNA的表达,但差异均无统计学意义CP>0.05); NEP1-40组能明显降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.01),促进IL-10 mRNA的表达(P<0.05),对TGF-β1 mRNA表达无明显作用(P>0.05)；血塞通+NEP1-40组能显著降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.01),促进IL-10、TGF-β1 mRNA的表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.采用改良的线栓法大鼠大脑中动脉栓塞术(MCAO)能够成功的模拟人类局灶性脑梗死疾病,经过练习、熟练掌握MCAO手术后,具有很高的造模成功率。2.NEP1-40通过抑制NgR1、RhoA及ROCK Ⅱ的表达,同时调节促炎因子IL-1β、TNF-α及抑炎因子IL-10、TGF-β1的表达,从而促进大鼠脑梗死后神经再生及神经功能的恢复。3.血塞通注射液通过抑制NgRl/RhoA/ROCKⅡ信号通路的表达,发挥类似NEP1-40的神经保护作用；同时具有抑制促炎因子IL-1β、TNF-α及促进抑炎因子IL-10表达的作用。血塞通注射液通过发挥综合的神经保护作用,从而促进大鼠脑梗死后神经再生及神经功能的恢复。